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Team:TU Darmstadt/Project/Transport
From 2012.igem.org
Transport
Ziel der Gruppe Transport ist es einige für den Transport von Terephthalsäure (TPA) verantwortlichen Proteine aus Comamonas testosteroni KF-1 in Escherichia coli zu exprimieren. TPA soll von E.coli aufgenommen werden, um es für den Metabolismus zugänglich zu machen und anschließend in andere für uns nützliche Stoffe umzuwandeln.
Terephthalsäure kann nur bei niedrigtem pH-Wert die Membran passieren, dies beeinflusst jedoch das Wachstum von E.coli sehr negativ. Daher versuchen wir ein Transportsystem zu finden und zu charakterisieren, das den Membrantransport unter optimalen Wachstumsbedingungen für E.coli ermöglicht.
Bei den aus C.testosteroni stammenden Proteinen handelt sich laut Literaturangaben um ein Tripartite Tricarboxylat Transportersystem, welches aus den drei Untereinheiten A, B und C besteht. A ist ein größeres Transmembranprotein mit 12 Transmembrandomänen, B ein kleineres mit nur 4 Transmembrandomänen. C ist ein spezifisches periplasmatisches Bindeprotein, das sich frei im Periplasma bewegt und an AB binden kann. Von der Funktion her ähneln sie den ABC-Transportern, jedoch besteht keine Ähnlichkeit in der Sequenz. C.testosteroni KF-1 besitzt zwei unterschiedliche A und B Proteine (A1 mit 505 aa, B1 mit 197 aa und A2 mit 503 aa, B2 mit 162 aa), die unspezifisch für viele verschiedene Substrate sind. A1B1C und A2B2C sollen zunächst auf den Plasmiden pSB1C3 und pSB1A2 in E.coli DH5α eingebracht werden und danach in einen Überexpressionsstamm, z.B. BL21(DE3)pLysS oder c 43 (de3) überfüht werden und unter Regulation eines Arabinosepromotors exprimiert werden.
Da das Transportsystem bislang noch nicht ausreichend charakterisiert wurde, wird zunächst geprüft welche Komponenten essentiell für den Transportmechanismus sind, bzw. welche Kombination der Untereinheiten überhaupt den Transport von TPA ins Zellinnnere ermöglicht.
Die Aufnahmeraten von TPA werden massenspektrometrisch und photometrisch überprüft. Mit anschließenden Funktionstests wird das Transprotsystem weiter charakterisiert.
continue with 3. Metabolism
