Team:TU Darmstadt/Project/Transport

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Revision as of 22:30, 19 September 2012

Transport

The goal for group "Transport" is to express comamonas testosteroni KF-1 transport proteins in Escherichia coli. The target proteins are regulating the Terephthalic acid (TPA) transport. The TPA transport is crucial to make it accessible for metabolism to useful substances in E. coli. TPA can only pass the membrane at low pH values, which negatively affect the growth of E. coli. Therefore, a suitable transport system is needed that operates under good growth conditions for E. coli. Based on literature the proteins from C.testosteroni are forming a tripartite tricarboxylate transport system. The system consists of three subunits called A, B and C. A is a large transmembrane protein with 12 transmembrane domains. It is acompanied by a smaller transmembrane protein with only 4 transmembrane domains. C is a specific periplasmatic bonding protein, which is moving freely in the periplasm and bonds to the AB units. The function is similar to ABC transporters, however the sequences are unrelated. C.testosteroni KF-1 owns two different A and B proteins (A1 with 505 aa, B1 with 197 aa and A2 with 503 aa, B2 with 162 aa). The proteins are naturally unspecific and can transport different substrates. Initially A1B1C and A2B2C shall be insert on pSB1C3 and pSB1A2 plasmides in E. coli DH5α. Afterwards they will be transferred in an overexpression strain like BL21(DE3)pLysS or c43 (de3) and expressed under arabinose promotor regulation.

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 == Transport ==
-Ziel der Gruppe Transport ist es einige für den Transport von Terephthalsäure (TPA) verantwortlichen Proteine aus Comamonas testosteroni KF-1 in Escherichia coli zu exprimieren. TPA soll von E.coli aufgenommen werden, um es für den Metabolismus zugänglich zu machen und anschließend in andere für uns nützliche Stoffe umzuwandeln.
+The goal for group "Transport" is to express ''comamonas testosteroni'' KF-1 transport proteins in ''Escherichia coli''. The target proteins are regulating the Terephthalic acid (TPA) transport. The TPA transport is crucial to make it accessible for metabolism to useful substances in ''E. coli''.
+TPA can only pass the membrane at low pH values, which negatively affect the growth of ''E. coli''. Therefore, a suitable transport system is needed that operates under good growth conditions for ''E. coli''.
-Terephthalsäure kann nur bei niedrigtem pH-Wert die Membran passieren, dies beeinflusst jedoch das Wachstum von E.coli sehr negativ. Daher versuchen wir ein Transportsystem zu finden und zu charakterisieren, das den Membrantransport unter optimalen Wachstumsbedingungen für E.coli ermöglicht.
+Based on literature the proteins from ''C.testosteroni'' are forming a tripartite tricarboxylate transport system. The system consists of three subunits called A, B and C. A is a large transmembrane protein with 12 transmembrane domains. It is acompanied by a smaller transmembrane protein with only 4 transmembrane domains. C is a specific periplasmatic bonding protein, which is moving freely in the periplasm and bonds to the AB units. The function is similar to ABC transporters, however the sequences are unrelated. ''C.testosteroni'' KF-1 owns two different A and B proteins (A1 with 505 aa, B1 with 197 aa and A2 with 503 aa, B2 with 162 aa). The proteins are naturally unspecific and can transport different substrates. Initially A1B1C and A2B2C shall be insert on pSB1C3 and pSB1A2 plasmides in ''E. coli'' DH5α. Afterwards they will be transferred in an overexpression strain like BL21(DE3)pLysS or c43 (de3) and expressed under arabinose promotor regulation.
-Bei den aus C.testosteroni stammenden Proteinen handelt sich laut Literaturangaben um ein Tripartite Tricarboxylat Transportersystem, welches aus den drei Untereinheiten A, B und C besteht. A ist ein größeres Transmembranprotein mit 12 Transmembrandomänen, B ein kleineres mit nur 4 Transmembrandomänen. C ist ein spezifisches periplasmatisches Bindeprotein, das sich frei im Periplasma bewegt und an AB binden kann. Von der Funktion her ähneln sie den ABC-Transportern, jedoch besteht keine Ähnlichkeit in der Sequenz. C.testosteroni KF-1 besitzt zwei unterschiedliche A und B Proteine (A1 mit 505 aa, B1 mit 197 aa und A2 mit 503 aa, B2 mit 162 aa), die unspezifisch für viele verschiedene Substrate sind. A1B1C und A2B2C sollen zunächst auf den Plasmiden pSB1C3 und pSB1A2 in E.coli DH5α eingebracht werden und danach in einen Überexpressionsstamm, z.B. BL21(DE3)pLysS oder c 43 (de3) überfüht werden und unter Regulation eines Arabinosepromotors exprimiert werden.
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-Da das Transportsystem bislang noch nicht ausreichend charakterisiert wurde, wird zunächst geprüft welche Komponenten essentiell für den Transportmechanismus sind, bzw. welche Kombination der Untereinheiten überhaupt den Transport von TPA ins Zellinnnere ermöglicht.
-Die Aufnahmeraten von TPA werden massenspektrometrisch und photometrisch überprüft. Mit anschließenden Funktionstests wird das Transprotsystem weiter charakterisiert.
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