Team:TU Darmstadt/Project/Transport

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Revision as of 09:04, 19 September 2012

Transport

Ziel der Gruppe Transport ist es einige für den Transport von Terephthalsäure (TPA) verantwortlichen Proteine aus Comamonas testosteroni KF-1 in Escherichia coli zu exprimieren. TPA soll von E.coli aufgenommen werden, um es für den Metabolismus zugänglich zu machen und anschließend in andere für uns nützliche Stoffe umzuwandeln.

Terephthalsäure kann nur bei niedrigtem pH-Wert die Membran passieren, dies beeinflusst jedoch das Wachstum von E.coli sehr negativ. Daher versuchen wir ein Transportsystem zu finden und zu charakterisieren, das den Membrantransport unter optimalen Wachstumsbedingungen für E.coli ermöglicht.

Bei den aus C.testosteroni stammenden Proteinen handelt sich laut Literaturangaben um ein Tripartite Tricarboxylat Transportersystem, welches aus den drei Untereinheiten A, B und C besteht. A ist ein größeres Transmembranprotein, B ein kleineres. C ist ein spezifisches periplasmatisches Bideprotein. Von der Funktion her ähneln sie den ABC-Transportern, jedoch besteht keine Ähnlichkeit in der Sequenz. C.testosteroni KF-1 besitzt zwei unterschiedliche A und B Proteine (A1 mit 505 aa, B1 mit 197 aa und A2 mit 503 aa, B2 mit 162 aa), die unspezifisch für viele verschiedene Substrate sind. A1B1C und A2B2C sollen zunächst in E.coli DH5α, in einen Überexpressionsstamm, z.B. BL21(DE3)pLysS oder c 43 (de3) überfüht werden und unter Regulation eines Arabinosepromotors exprimiert werden.

Da das Transportsystem bislang noch nicht ausreichend charakterisiert wurde, wird zuerst geprüft welche Komponenten essentiell für den Transportmechanismus sind.

C.testosteroni KF-1 besitzt zwei unterschiedliche A und B Proteine die unspezifisch für viele verschiedene Substrate sind. Die Herausforderung ist hierbei die Kombination an Untereinheiten zu finden, die den TPA Transport in E.coli ermöglicht.

Die Aufnahmeraten von TPA werden massenspektrometrisch und photometrisch überprüft. Mit anschließenden Funktionstests wird das Transprotsystem weiter charakterisiert.

continue with 3. Metabolism

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 == Transport ==
-Ziel der Gruppe Transport ist es Proteine aus Comamonas testosteroni KF-1 für den Membrantransport von Terephthalsäure (TPA) in Escherichia coli zu überführen und zu etablieren. Die Terephthalsäure soll von E.coli aufgenommen werden, um sie für den Metabolismus zugänglich zu machen und anschließend in andere für uns nützliche Stoffe umzuwandeln.
+Ziel der Gruppe Transport ist es einige für den Transport von Terephthalsäure (TPA) verantwortlichen Proteine aus Comamonas testosteroni KF-1 in Escherichia coli zu exprimieren. TPA soll von E.coli aufgenommen werden, um es für den Metabolismus zugänglich zu machen und anschließend in andere für uns nützliche Stoffe umzuwandeln.
-Terephthalsäure kann nur bei niedrigtem pH-Wert die Membran passieren, dies kann jedoch das Wachstum von E.coli negativ beeinflussen. Daher versuchen wir ein Transportsystem zu etablieren und zu charakterisieren, das den Membrantransport unter optimalen Wachstumsbedingungen für E.coli ermöglicht.
+Terephthalsäure kann nur bei niedrigtem pH-Wert die Membran passieren, dies beeinflusst jedoch das Wachstum von E.coli sehr negativ. Daher versuchen wir ein Transportsystem zu finden und zu charakterisieren, das den Membrantransport unter optimalen Wachstumsbedingungen für E.coli ermöglicht.
-Bei den aus C.testosteroni stammenden Proteinen handelt sich laut Literaturangaben um ein Tripartite Tricarboxylate Transportersystem, welches aus den drei Untereinheiten A, B und C besteht. A ist das größere Transmembranprotein, B das kleinere. C ist ein spezigisches periplasmatisches Bideprotein. Von der Funktion her ähneln sie den ABC-Transportern, jedoch besteht keine Ähnlichkeit in der Sequenz. Diese sollen nach Genvervielfältigung in E.coli DH5α, in einen Überexpressionsstamm, z.B. BL21(DE3)pLysS oder c 43 (de3) überfüht werden und unter Regulation eines Arabinosepromotors exprimiert werden.
+Bei den aus C.testosteroni stammenden Proteinen handelt sich laut Literaturangaben um ein Tripartite Tricarboxylat Transportersystem, welches aus den drei Untereinheiten A, B und C besteht. A ist ein größeres Transmembranprotein, B ein kleineres. C ist ein spezifisches periplasmatisches Bideprotein. Von der Funktion her ähneln sie den ABC-Transportern, jedoch besteht keine Ähnlichkeit in der Sequenz. C.testosteroni KF-1 besitzt zwei unterschiedliche A und B Proteine (A1 mit 505 aa, B1 mit 197 aa und A2 mit 503 aa, B2 mit 162 aa), die unspezifisch für viele verschiedene Substrate sind. A1B1C und A2B2C sollen zunächst in E.coli DH5α, in einen Überexpressionsstamm, z.B. BL21(DE3)pLysS oder c 43 (de3) überfüht werden und unter Regulation eines Arabinosepromotors exprimiert werden.
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