"
Team:UC Chile/Cyano/Labook/september
From 2012.igem.org
September
(in spanish)
RESUMEN SEPTIEMBRE
Se mando a secuenciar y validó BBa_K743015 obtenido los últimos días de agosto. A finales de agosto se hizo una transformación de Synechosystis pcc 6803 con: Int_C BBa_K743004 BBa_K743014 BBa_K743016 psbAB+GFP+pPMQAK1 De las cuales IntC no transformó. Se hizo colony PCR amplificando diversas partes de BBa_K743004 y psbAB+GFP+pPMQAK1, de los cuales se obtuvieron resultados positivos solo para BBa_K743004.
Se picó e inoculo en matraz de 500ml BBa_K743014 para probar inducción por decanal. El inoculo creció en kanamicina pero no produjo lumiscencia en presencia de decanal. Se recreció en placas de kanamicina BBa_K743004 y psbAB+GFP+pPMQAK1 pero no crecieron. El constructo psbAB+GFP+pPMQAK1se plaqueo en kanamicina tres veces más, pero nunca creció, por lo que pensamos que realmente no transformo.
Se transformo nuevamente Synechosystis pcc 6803 pero ahora es incubada en condiciones optimas (Luz continua y 30°C): BBa_K743004. BBa_K743009 BBa_K743016 BBa_K743006 BBa_K743014 BBa_K743015 IntC Control – (KAN) Control – (CLO) Nuevamente IntC no transformó. Pero el resto de las transformaciones parecen estar creciendo. Se plaquearon en placas de kanamicina BBa_K743014, BBa_K743016 desde las placas de transformación y se realizo un colony PCR para BBa_K743014 amplificando tanto LuxAB como LuxAB con su promotor.
Se volvió a realizar una ronda de transformación de Synechosystis pcc 6803 con las mismas condiciones y constructos que la última. Las dos últimas transformaciones dieron controles negativos y colonias individuales para la mayoría de los constructos con excepción de IntC que no transformó. Se picaron colonias desde todas las trasformaciones y replaquearon en placas con kanamicina. En estas placas nuestras Synechosystys pcc 6803 crecieron en kanamicina, lo que nos confirma que existió transformación en ellas. Además, estas placas fueron sembradas en medio líquido con kanamicina donde también proliferaron. Luego de multiples replaqueos en kanamicina se realizo un Colony PCR masivo de las transformantes de las dos últimas rondas de transformación, donde tanto BBa_K743015 como BBa_K743016 confirmaron su transformación.
Debido a la gran cantidad de intentos fallidos para transformar con el plásmido IntC de yhuta, este se digirió dando bandas de tamaños incorrectos, por lo que se mandó a secuenciar.
Se creó un nuevo incubador de Synechosystis pcc 6803 a partir de un refrigerador en mal estado.
Se realizo la Caracterización de LuxBrick (link?).
Se realizó una curva de crecimiento (link?) para Synechosystis pcc 6803 a partir de un inoculo con OD730:0.4800. Se inocularon:
3 matraces con 1ml de inoculo en 150ml de BG11normal.
1 control con 1ml de inoculo en 150ml de BG110.
- Shaker ~90 RPM.
Se realizó el experimento para la caracterización de T5 (Gibson partes pequeñas). Se miraron LuxBrick inducidas bajo microscopio y se concluyo que estas no son visibles en microoscopía. Se amplificaron partes correspondientes y se procedió al Gibson y transformación de dos nuevos constructos: BBa_K743017 y BBa_K743018. Estos fueron validados mediante PCR y digestión, y se mandaron a secuenciar. Se realizo medición de bioluminiscencia con distintos aldheidos (decanal y dodecanal) para diferentes constructos con luciferasa mediante Iluminometro.
