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Team:TU Darmstadt/Project/Transport
From 2012.igem.org
Transport
Ziel der Gruppe Transport ist es Proteine aus Comamonas testosteroni KF-1 für den Membrantransport von Terephthalsäure (TPA) in Escherichia coli zu überführen und zu etablieren. Die Terephthalsäure soll von E.coli aufgenommen werden, um sie für den Metabolismus zugänglich zu machen und anschließend in andere für uns nützliche Stoffe umzuwandeln.
Terephthalsäure kann nur bei niedrigtem pH-Wert die Membran passieren, dies kann jedoch das Wachstum von E.coli negativ beeinflussen. Daher versuchen wir ein Transportsystem zu etablieren und zu charakterisieren, das den Membrantransport unter optimalen Wachstumsbedingungen für E.coli ermöglicht.
Bei den aus C.testosteroni stammenden Proteinen handelt sich laut Literaturangaben um ein Tripartite Tricarboxylate Transportersystem, welches aus den drei Untereinheiten A, B und C besteht. A ist das größere Transmembranprotein, B das kleinere. C ist ein periplasmatisches Bideprotein. Von der Funktion her ähneln sie den ABC-Transportern, jedoch besteht keine Ähnlichkeit in der Sequenz. Diese sollen nach Genvervielfältigung in E.coli DH5α, in einen Überexpressionsstamm, z.B. BL21(DE3)pLysS oder c 43 (de3) überfüht werden und unter Regulation eines Arabinosepromotors exprimiert werden.
Da das Transportsystem bislang noch nicht ausreichend charakterisiert wurde, wird zuerst geprüft welchen Komponenten essentiell für den Transportmechanismus sind. Die Komponenten A und B sind transmembranständige Proteine und die Komponente C stellt ein spezifisches Bindeprotein da.
C.testosteroni KF-1 besitzt zwei unterschiedliche A und B Proteine die unspezifisch für viele verschiedene Substrate sind. Die Herausforderung ist hierbei die Kombination an Untereinheiten zu finden, die den TPA Transport in E.coli ermöglicht.
Die Aufnahmeraten von TPA werden massenspektrometrisch und photometrisch überprüft. Mit anschließenden Funktionstests wird das Transprotsystem weiter charakterisiert.
continue with 3. Metabolism
