Team:KIT-Kyoto/c6h12o6

From 2012.igem.org

(Difference between revisions)
Line 7: Line 7:
<h2>August 1st</h2>
<h2>August 1st</h2>
<br>
<br>
-
<strong>*TNFA and API2</strong>
+
<strong>*TNFAIP3</strong>
-
<br><br>
+
<br>
 +
<br>
 +
Composition
<Table Border Cellspacing="0">
<Table Border Cellspacing="0">
<Tr><Td>　　</Td><Td>　sample1　</Td></Tr>
<Tr><Td>　　</Td><Td>　sample1　</Td></Tr>
Line 22: Line 24:
</Table>
</Table>
<br>
<br>
 +
<Table Border Cellspacing="0">
<Table Border Cellspacing="0">
Line 34: Line 37:
<br>
<br>
-
<Table Border Cellspacing="0">
 
-
<Tr><Td>　　</Td><Td>　sample1　</Td><Td>　sample2　</Td><Td>　sample3　</Td><Td>　sample4　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　10ng/μL API2-MALT1　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　1μL　</Td><Td>　1μL　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　10× KOD plus buffer　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　2μL　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　2mM dNTPs　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　2μL　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　25mM MgSO<sub>4</sub>　</Td><Td>　0.8μL　</Td><Td>　0.8μL　</Td><Td>　0.8μL　</Td><Td>　0.8μL　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　10P 5'primer　</Td><Td>　0.6μL　</Td><Td>　0.6μL　</Td><Td>　0.6μL　</Td><Td>　0.6μL　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　10P 3'primer　</Td><Td>　0.6μL　</Td><Td>　0.6μL　</Td><Td>　0.6μL　</Td><Td>　0.6μL　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　KOD plus　</Td><Td>　0.4μL　</Td><Td>　0.4μL　</Td><Td>　0.4μL　</Td><Td>　0.4μL　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　dH<sub>2</sub>O　</Td><Td>　11.6μL　</Td><Td>　11.6μL　</Td><Td>　12.6μL　</Td><Td>　12.6μL　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　total　</Td><Td>　20μL　</Td><Td>　20μL　</Td><Td>　20μL　</Td><Td>　20μL　</Td></Tr>
 
-
</Table>
 
-
<br>
 
-
<Table Border Cellspacing="0">
 
-
<Tr><Td>　temperature　</Td><Td>　time　</Td><Td>　cycle　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　95°C　</Td><Td>　2min　</Td><Td>　　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　95°C　</Td><Td>　15sec　</Td><Td>　25cycle　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　50°C(sample1,3)or55°C(sample2,4)　</Td><Td>　30sec　</Td><Td>　25cycle　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　68°C　</Td><Td>　3min30sec　</Td><Td>　25cycle　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　68°C　</Td><Td>　3min30sec　</Td><Td>　　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　14°C　</Td><Td>　∞　</Td><Td>　　</Td></Tr>
 
-
</Table>
 
-
<br>
 
<h2>August 2nd</h2>
<h2>August 2nd</h2>
Line 64: Line 44:
<br><br>
<br><br>
 +
Composition
<Table Border Cellspacing="0">
<Table Border Cellspacing="0">
-
<Tr><Td>　　</Td><Td>　1-2　</Td><Td>　1-3　</Td></Tr>
+
<Tr><Td>　　</Td><Td>　1-2　</Td></Tr>
-
<Tr><Td>　DNA sample　</Td><Td>　10μL　</Td><Td>　20μL　</Td></Tr>
+
<Tr><Td>　DNA sample　</Td><Td>　10μL　</Td></Tr>
-
<Tr><Td>　6×Dye　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　4μL　</Td></Tr>
+
<Tr><Td>　6×Dye　</Td><Td>　2μL　</Td></Tr>
-
<Tr><Td>　total　</Td><Td>　12μL　</Td><Td>　25μL　</Td></Tr>
+
<Tr><Td>　total　</Td><Td>　12μL　</Td></Tr>
</Table>
</Table>
-
<br><br>
+
 
 +
<br>
 +
<br>
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/e/e0/0802.png" width="500" height="300">
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/e/e0/0802.png" width="500" height="300">
<br>
<br>
<br>
<br>
 +
 +
Composition
<Table Border Cellspacing="0">
<Table Border Cellspacing="0">
<Tr><Td>　　</Td><Td>　1-2　</Td></Tr>
<Tr><Td>　　</Td><Td>　1-2　</Td></Tr>
Line 80: Line 65:
<Tr><Td>　total　</Td><Td>　108μL　</Td></Tr>
<Tr><Td>　total　</Td><Td>　108μL　</Td></Tr>
</Table>
</Table>
-
<br><br>
+
 
 +
<br>
 +
<br>
 +
 
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/1/19/0802-2.png" width="500" height="300">
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/1/19/0802-2.png" width="500" height="300">
<br><br>
<br><br>
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/0/0e/0802-3.png" width="500" height="300">
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/0/0e/0802-3.png" width="500" height="300">
-
<br><br>
+
<br>
-
<Table Border Cellspacing="0">
+
-
<Tr><Td>　10ng/μL API2-MALT1　</Td><Td>　5μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　10×KOD plus buffer　</Td><Td>　10μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　2mM dNTPs　</Td><Td>　10μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　25mM MgSO<sub>4</sub>　</Td><Td>　4μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　10P 5'primer　</Td><Td>　3μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　10P 3'primer　</Td><Td>　3μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　KOD plus　</Td><Td>　2μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　dH<sub>2</sub>O　</Td><Td>　63μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　total　</Td><Td>　100μL　</Td></Tr>
+
-
</Table>
+
<br>
<br>
-
<Table Border Cellspacing="0">
+
 
-
<Tr><Td>　temperature　</Td><Td>　time　</Td><Td>　cycle　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　95°C　</Td><Td>　2min　</Td><Td>　　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　95°C　</Td><Td>　15sec　</Td><Td>　35cycle　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　55°C　</Td><Td>　30sec　</Td><Td>　35cycle　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　68°C　</Td><Td>　3min30sec　</Td><Td>　35cycle　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　68°C　</Td><Td>　3min30sec　</Td><Td>　　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　14°C　</Td><Td>　∞　</Td><Td>　　</Td></Tr>
+
-
</Table>
+
-
<br>
+
<strong>Result</strong>
<strong>Result</strong>
<br><br>
<br><br>
-
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/1/18/0802-4.png" width="500" height="300">
+
 
-
<br><br>
+
<h2>August 3rd</h2>
<h2>August 3rd</h2>
Line 127: Line 94:
<br>
<br>
-
 
+
<br>
-
<Table Border Cellspacing="0">
+
-
<Tr><Td>　　</Td><Td>　sample1　</Td><Td>　sample2　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　10ng/μL AIP2-MALT1　</Td><Td>　2.5μL　</Td><Td>　2.5μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　10×KOD plus buffer　</Td><Td>　5μL　</Td><Td>　5μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　2mM dNTPs　</Td><Td>　5μL　</Td><Td>　5μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　25mM MgSO<sub>4</sub>　</Td><Td>　2μL　</Td><Td>　2.4μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　10P 5'primer　</Td><Td>　1.5μL　</Td><Td>　1.5μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　10P 3'primer　</Td><Td>　1.5μL　</Td><Td>　1.5μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　KOD plus　</Td><Td>　1μL　</Td><Td>　1μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　dH<sub>2</sub>　</Td><Td>　31.5μL　</Td><Td>　31.1μL　</Td></Tr>
+
-
<Tr><Td>　total　</Td><Td>　50μL　</Td><Td>　50μL　</Td></Tr>
+
-
</Table>
+
<br>
<br>
-
 
-
<Table Border Cellspacing="0">
 
-
<Tr><Td>　temperature　</Td><Td>　time　</Td><Td>　cycle　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　95°C　</Td><Td>　2min　</Td><Td>　　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　95°C　</Td><Td>　15sec　</Td><Td>　35cycle　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　55°C　</Td><Td>　30sec　</Td><Td>　35cycle　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　68°C　</Td><Td>　3min30sec　</Td><Td>　35cycle　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　68°C　</Td><Td>　3min30sec　</Td><Td>　　</Td></Tr>
 
-
<Tr><Td>　14°C　</Td><Td>　∞　</Td><Td>　　</Td></Tr>
 
-
</Table>
 
-
<br>
 
-
<br>
 
-
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/d/df/0803.png" width="500" height="300">
 
-
<br><br>
 
<h2>August 4th</h2>
<h2>August 4th</h2>
Line 182: Line 123:
<br>
<br>
<strong>*TNFA and API2</strong>
<strong>*TNFA and API2</strong>
-
<br><br>
 
-
<br><br>
 
-
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/2/2e/0807.png" width="500" height="300">
 
<br><br>
<br><br>
-
 
<Table Border Cellspacing="0">
<Table Border Cellspacing="0">
Line 196: Line 133:
</Table>
</Table>
<br>
<br>
 +
 +
 +
<br><br>
 +
<img src="https://static.igem.org/mediawiki/2012/2/2e/0807.png" width="500" height="300">
 +
<br><br>
 +
 +

Revision as of 04:44, 25 September 2012

August 1st


*TNFAIP3

Composition
　　　sample1　
　10ng/μL TNFAIP3　　6μL　
　10× KOD plus buffer　　10μL　
　2mM dNTPs　　10μL　
　25mM MgSO4　　3.2μL　
　10P 5'primer　　3μL　
　10P 3'primer　　3μL　
　KOD plus　　2μL　
　dH2O　　62.8μL　
　total　　100μL　

　temperature　　time　　cycle　
　95°C　　2min　　　
　95°C　　15sec　　25cycle　
　60°C　　30sec　　25cycle　
　68°C　　2min30sec　　25cycle　
　68°C　　2min30sec　　　
　14°C　　∞　　　

August 2nd


*TNFA and API2

Composition
　　　1-2　
　DNA sample　　10μL　
　6×Dye　　2μL　
　total　　12μL　




Composition
　　　1-2　
　DNA sample　　90μL　
　6×Dye　　18μL　
　total　　108μL　






Result

August 3rd


*TNFA and API2

　attB TNFAIP3(80ng/μL)　　1μL　
　pDONR(455ng/μL)　　0.35μL　
　TE buffer　　7.65　
　total　　9μL　



August 4th


*TNFA and API2

August 5th


*TNFA and API2





August 6th


*TNFA and API2

August 7th


*TNFA and API2

　　　pDONR　　BP TNFA-1　　BP TNFA-2　
　DNA sample　　1μL　　1μL　　1μL　
　6×Dye　　1μL　　1μL　　1μL　
　dH2O　　4μL　　4μL　　4μL　
　total　　6μL　　6μL　　6μL　





　BP TNFA-2　　2μL　
　pTFW(Destination vector)　　0.5μL　
　TE buffer　　6.5μL　
　total　　9μL　

WEEK１終わり

August 8th


*TNFA and API2

August 9th


*TNFA and API2

　DNA sample　　1μL　
　10×H buffer　　0.5μL　
　EcoRⅠ　　0.2μL　
　dH2O　　3.3μL　
　total　　5μL　




　　　1-2　
　50ng/μL LR TNFA-1　　1μL　
　10×rTaq buffer　　2μL　
　2mM dNTPs　　2μL　
　25mM MgCl2　　0.8μL　
　10P 5'primer　　0.6μL　
　10P 3'primer　　0.6μL　
　rTaq　　0.4μL　
　dH2O　　12.6μL　
　total　　20μL　

　temperature　　time　　cycle　
　95°C　　2min　　　
　95°C　　15sec　　25cycle　
　55°C　　30sec　　25cycle　
　68°C　　2min30sec　　25cycle　
　68°C　　2min30sec　　　
　14°C　　∞　　　

August 10th


*TNFA and API2





August 13th


*TNFA and API2

　1-1　　1μL　
　10×M buffer　　0.5μL　
　Hind Ⅲ　　0.2μL　
　dH2O　　3.3μL　
　total　　5μL　




August 14th


*TNFA and API2

　1-1　　sample1　
　10ng/μL TNFAIP3　　6μL　
　10×KOD plus buffer　　10μL　
　2mM dNTPs　　10μL　
　25mM MgSO4　　3.2μL　
　10P 5'primer　　3μL　
　10P 3'primer　　3μL　
　KOD plus　　2μL　
　dH2O　　62.8μL　
　total　　100μL　

　temperature　　time　　cycle　
　95°C　　2min　　　
　95°C　　15sec　　25cycle　
　60°C　　30sec　　25cycle　
　68°C　　2min30sec　　25cycle　
　68°C　　2min30sec　　　
　14°C　　∞　　　




WEEK2終わり

August 20th


TNFA and API2

1. Reproduction of DNA from gel
We did agarose gel electrophoresis (0.7% gel).

Composition
　　　a product of PCR attB TNFAIP3(8/1)　
　DNA sample　　90μL　
　6×Dye　　18μL　
　Total　　108μL　

We separated 54uL×2 from 108uL (sample) and we did electrophoresis (54uL sample and 1kb marker 5uL).We separated gel containing DNA.

Results
We isolated DNA from these gels by QIA quick Gel Extraction Kit.
Finally we melt DNA to TE Buffer(40uL)

August 21st


TNFA and API2

1. Density measurement of attB TNFAIP3
We did agarose gel electrophoresis (0.7% gel). (1kb marker-3uL, 5times dilution attB TNFAIP3-1uL (make August 20 ), 10times dilution-1uL, 1kb marker-2uL, 15times dilution-1uL, 20times dilution-1uL, 1kb marker-1uL )

Results We estimated attB TNFAIP3(we make this time) is 35ng/uL

2. BP reaction
We adjusted solution (vials) on 1.5mL tube to next composition.
　attB TNFAIP3(35ng/μL)　　2μL　
　pDONR(150ng/μL)　　1μL　
　TE buffer　　5μL　
　Total　　8μL　

We added BP Clonase Ⅱ enzyme mix-2uL to this vials.
We incubated these vials for 2hour at 25˚C. Next we did BP reaction

3. Transformation
We added BP TNFAIP3-2uL to XL1-Blue-100uL and we did Transformation.
Finally we spread 10uL, 40uL and 100uL on plate of LB Kanamycin(＋) and we keep 37℃ overnight.

August 22nd


TNFA and API2

We separated six colonies from 40uL spread plate of BP TNFAIP3 (make August 21 ) .
We cultivated these colonies on 2.5mL Kanamycin(＋) LB culture medium and we kept shaking this medium overnight.

Retrieved from "http://2012.igem.org/Team:KIT-Kyoto/c6h12o6"