Team:Kyoto/Florigen/Project

Introduction

What is Florigen?

植物の開花を自在にコントロールするのは人類の夢であり、多くの研究がなされてきた。
花を咲かせる植物ホルモンであるフロリゲンは、その存在が示唆され命名されてから70年間謎のままであったが、近年その正体が明らかになってきた。
フロリゲンの実体は、FLOWERING LOCUS T (FT)遺伝子にコードされる175アミノ酸、約20kDaの小さなタンパク質である。
FT遺伝子はいくつかの条件―例えばlong photoperiods, vermalisation, ageなど―によりleaf phloem companion cellsにおいて発現が促進される。転写されたFT mRNAは、タンパク質へと翻訳された後に師管を通って茎頂shoot apexへと移行する。そこでFTはtranscriptional factorであるFDと結合し、floral meristem identity geneであるAPETALA 1 (AP1)やFRUITFUL (FUL), LEAFY (LFY)をactivateする。これらの遺伝子は、shoot meristemが花芽へと形態を変化させるのに重要な働きをする。
つまり、FTを産生する大腸菌はまるでflower fairyのように花を咲かせることができるだろう。

What is R9 peptide?

Flower Fairy E.coliを実現するためには、大腸菌から分泌されたFTが、植物細胞内へと運ばれなければならない。
FTタンパク質を植物細胞内へと輸送するため、私たちはCell penetrating peptide (CPP)の一つであるpolyarginineペプチドを用いた。
私たちが使ったのは9つのアルギニンから成るR9ペプチドである。ポリアルギニンペプチドは、その塩基性により細胞膜に作用して特殊なエンドサイトーシスであるmacropinocytosisを引きおこすと考えられている。Macropinocytosisは、細胞膜が陥入するのではなくactin membraneのprotrusionがvesicle (macropinosomes) へと成長することにより起こり、receptorは不要である。
植物は細胞壁をもつにもかかわらず、CPPによってタンパク質などの生体分子を細胞内へと取り込むことが報告されている。

Method

1. Expression of FT in E.coli

Construction

FT gene has 2 BioBrick restriction enzyme sites, EcoR1 and Pst1. So we did mutation to delete the sites before we start construction.
We constructed the following plasmid to check the expression of FT by Western blotting, using FT specific antibody.
FT is regulated by T7 promoter, BBa_I719005 and strong RBS, BBa_B0034. コンストラクション図

Western blotting

Cells were precultured overnight and diluted into fresh SOC medium. IPTG was added when OD600 was approx. 0.7, then cells were incubated for 4h at 37°C. µL of culture was used for SDS-PAGE.

2. GFP imaging assay for characterizing R9 peptide

Following plasmid was constructed to check the function of R9 peptide.

3. RT-PCR assay for characterizing FT