Team:Potsdam Bioware/Lab/Safety

Safety questions:

   1. Would any of your project ideas raise safety issues concerning researchers, the public or the environment?

The current project and further project ideas of the Potsdam Bioware Team 2012 are classified as biosafety level one (S1) work. None of the ideas do raise additional safety issues to the public, the environment or researchers. We comply with safety regulations given by the law and its amendments, including but not limited to handling and storage of genetically modified organisms and the documentation of the work.

   2. Do any of the new BioBrick parts (or devices) that you made this year raise any safety issues?

No, none of our generated BioBrick parts or devices will raise any safety issues concerning the public or the environment.

   3. Is there a local biosafety group, committee, or review board at your institution?

The University of Potsdam supervises biological and chemical laboratories and works according to federal and state regulations. A local biosafety officer has been appointed for the lab and the project. About twice a year, the laboratory is physically inspected by the state Authority for Biotechnological Laboratories to ensure compliance with the law and regulations. In Germany, the work with genetically modified organisms is regulated by the ‘Law on Genetic Engineering’ (Gesetz zur Regelung der Gentechnik, GenTG) and amendments of the ”Gentechnik-Sicherheitsverordnung (GenTSV)”, the “Gentechnik-Verfahrensverordnung (GenTVfV)” and the “Gentechnik-Aufzeichnungsverordnung (GenTAufzV)”.

Following federal law, the university provides standard operating instructions for biological & chemical laboratories. All employees and students are instructed before starting to work and attendance is documented by a signature. Rules and instructions are controlled by a safety officer for 'work-, environment- and fire-safety', who is located on our campus.

   4. Do you have any other ideas how to deal with safety issues that could be useful for future iGEM competitions? How could parts, devices and systems be made even safer through biosafety engineering?

With the beginning widespread use of synthetic genes, devices and systems the standard safety classification based on originating and accepting organism is becoming less appropriate. A more abstracted view of BioBricks with respect to their function and potential interference at the molecular, cellular and organismic level is advised. Known as well as potential risks could be listed in a specific section for each BioBrick in the Partsregistry. In addition to the safety assessment, each iGEM group could give a short assessment of the technology impact based on intended and, if applicable, unintended use.

Safety assessment

General procedure

In Germany, the work with genetically modified organisms is regulated by:

• the [http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/PDF/de/Gesetze/a01__gentechnikgesetz,property=pdf,bereich=bio,sprache=de,rwb=true.pdf ‘Law on Genetic Engineering’ (-> Gesetz zur Regelung der Gentechnik, GenTG)].

Next to the law ordinances (Verordnungen) are in place

• [http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/PDF/de/Gesetze/a011__gentechnikSicherheitsverordnung,property=pdf,bereich=bio,sprache=de,rwb=true.pdf ->"Gentechnik-Sicherheitsverordnung (GenTSV)"]

• [http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/PDF/de/Gesetze/a012__gentechnikVerfahrensverordnung,property=pdf,bereich=bio,sprache=de,rwb=true.pdf ->“Gentechnik-Verfahrensverordnung (GenTVfV)”]

• [http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/PDF/de/Gesetze/a013__gentechnikAufzeichnungsverordnung,property=pdf,bereich=bio,sprache=de,rwb=true.pdf ->“Gentechnik-Aufzeichnungsverordnung (GenTAufzV)”]

• Safety with regard to biological agents in general (with or without genetic modification) is regulated by the ordinance [http://www.gesetze-im-internet.de/bundesrecht/biostoffv/gesamt.pdf -> "Verordnung über Sicherheit und Gesundheitsschutz bei Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen (Biostoffverordnung (BioStoffV)].

A Central Comittee on Biological Safety [http://www.bvl.bund.de/DE/06_Gentechnik/03_Antragsteller/06_Institutionen_fuer_biologische_Sicherheit/01_ZKBS/gentechnik_zkbs_node.html( -> "Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit, ZKBS")] supervises details. As a reference and to ease the classification of biosafety risks the ZKBS provides a database with biosafety levels for (see also technical rules below):

• • [http://apps2.bvl.bund.de/CGI/Lasso/organismen/action.lasso?-response=search.lasso -> organisms]
  • [http://apps2.bvl.bund.de/cellswww/protected/main/cell.do -> cell lines]
  • [http://apps2.bvl.bund.de/vectorwww/protected/main/vector.do -> vectors]

At the lowest level of legislation, technical rules apply. For biological agents these are the [http://www.baua.de/de/Themen-von-A-Z/Biologische-Arbeitsstoffe/TRBA/TRBA.html -> "The Technical Rules for Biological Agents (TRBA)" (Technische Regeln für Biologische Arbeitsstoffe (TRBA))]:

• • Laboratory safety with regard to biological agents is specified in TRBA 100: [http://www.baua.de/de/Themen-von-A-Z/Biologische-Arbeitsstoffe/TRBA/pdf/TRBA-100.pdf?__blob=publicationFile&v=3" -> German: Schutzmaßnahmen für gezielte und nicht gezielte Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen in Laboratorien"]; [http://www.baua.de/en/Topics-from-A-to-Z/Biological-Agents/TRBA/pdf/TRBA-100.pdf?__blob=publicationFile&v=2 -> English: Protective Measures for Specific and Non-specific Activities involving Biological Agents in Laboratories.]
  • [http://www.baua.de/en/Topics-from-A-to-Z/Biological-Agents/TRBA/pdf/TRBA-400.pdf?__blob=publicationFile&v=2 -> TRBA 400: Guideline for Risk Assessment and for the Instruction of Employees in relation to Activities with Biological Agents]
  • [http://www.baua.de/en/Topics-from-A-to-Z/Biological-Agents/TRBA/pdf/TRBA-450.pdf?__blob=publicationFile&v=2 -> TRBA 450 Criteria for the Classification of Biological Agents]
  • [ -> TRBA http://www.baua.de/de/Themen-von-A-Z/Biologische-Arbeitsstoffe/TRBA/pdf/TRBA-466.pdf?__blob=publicationFile&v=6 -> TRBA 466 Einstufung von Prokaryonten (Bacteria und Archaea) in Risikogruppen]
  • [http://www.baua.de/de/Themen-von-A-Z/Biologische-Arbeitsstoffe/TRBA/pdf/TRBA-468.pdf?__blob=publicationFile&v=2 -> TRBA 468: List of cell lines and work with cell culture]
  • [http://www.baua.de/en/Topics-from-A-to-Z/Biological-Agents/TRBA/pdf/TRBA-500.pdf?__blob=publicationFile&v=2 ->TRBA 500: Basic Measures to be taken for Activities involving Biological Agents]

Chemical hazards are regulated by:

• [http://www.gesetze-im-internet.de/bundesrecht/chemg/gesamt.pdf -> "Gesetz zum Schutz vor gefährlichen Stoffen (Chemikaliengesetz - ChemG)"]
• [http://www.baua.de/de/Themen-von-A-Z/Gefahrstoffe/Rechtstexte/pdf/Gefahrstoffverordnung.pdf?__blob=publicationFile&v=7 -> "Gefahrstoffverordnung – GefStoffV"]
• [http://www.baua.de/de/Themen-von-A-Z/Gefahrstoffe/TRGS/TRGS.html ->Technische Regeln für Gefahrstoffe (TRGS)]
  • [http://www.baua.de/de/Themen-von-A-Z/Gefahrstoffe/TRGS/pdf/TRGS-526.pdf;jsessionid=10DC99320B323576526DC6EF8B8BE4F9.1_cid246?__blob=publicationFile&v=3 -> TRGS 526 Laboratorien]

General Worker safety is regulated by:

• [http://www.gesetze-im-internet.de/bundesrecht/betrsichv/gesamt.pdf -> "Verordnung über Sicherheit und Gesundheitsschutz bei der Bereitstellung von Arbeitsmitteln und deren Benutzung bei der Arbeit, über Sicherheit beim Betrieb überwachungsbedürftiger Anlagen und über die Organisation des betrieblichen Arbeitsschutzes (BetrSichV)"]

All these regulations are summarized in a standard operating instruction for biological & chemical laboratories given by the University and adapted to each specific lab by the project leaders.

Potsdam Bioware Project 2012

Our laboratory is registered as a Biosafety Level 1 (BSL 1) laboratory according to the [http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/PDF/de/Gesetze/a011__gentechnikSicherheitsverordnung,property=pdf,bereich=bio,sprache=de,rwb=true.pdf ”Gentechnik-Sicherheitsverordnung (GenTSV)”].
Furthermore, we had to rate the project for the appropriate authorities and prove that all organisms and plasmids are classified as BSL 1. The plasmids that we used are standard components classified as BSL 1.
Organisms:

E. coli XL1-Blue

Level 1 [http://apps2.bvl.bund.de/strainwww/protected/main/strain.do?method=detail&theId=54&d-49653-p=null German Federal Office for Consumer Protection and Food Safety]
The XL1-Blue strain allows blue-white color screening for recombinant plasmids and is an excellent host strain for routine cloning applications using plasmid or lambda vectors. XL1-Blue Genotype: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]. (Genes listed signify mutant alleles. Genes on the F´ episome, however, are wild-type unless indicated otherwise). XL-1 cells are tetracycline resistant. XL1-Blue cells are endonuclease (endA) deficient, which greatly improves the quality of miniprep DNA, and are recombination (recA) deficient, improving insert stability. The hsdR mutation prevents the cleavage of cloned DNA by the EcoK endonuclease system. The lacIqZΔM15 gene on the F´ episome allows blue-white color screening.

CHO cell line

Level 1 [http://apps2.bvl.bund.de/cellswww/protected/main/cell.do?method=detail&theId=13&d-49653-p=null German Federal Office for Consumer Protection and Food Safety]
Cell line: CHO-K1 DSMZ no.: ACC 110; Species: Chinese hamster (Cricetulus griseus); Cell type: ovary cells Origin: subclone from parental CHO cell line that was initiated from an ovary biopsy of an adult Chinese hamster in 1957.

HEK 293 cell line (AAV-HEK Zellen)

Level 1 [http://apps2.bvl.bund.de/cellswww/protected/main/cell.do?method=detail&theId=73&d-49653-p=null German Federal Office for Consumer Protection and Food Safety]
We recommend preparing adeno-associated recombinant virus stocks using the AAV-293 cell line provided. The AAV-293 cells provided are derived from the commonly used HEK293 cell line, but produce higher viral titers. HEK293 cells are human embryonic kidney cells that have been transformed by sheared adenovirus type 5 DNA.2 AAV-293 cells, like HEK293 cells, produce E1 in trans, allowing the production of infectious virus particles when cells are transfected with E1-deleted adenovirus vectors or when co-transfected with the three AAV Helper-Free System plasmids (an ITR-containing plasmid, pAAV-RC, and pHelper).

HT1080 cell line (AAV-HT1080)

Level 1 ATCC® Number: CCL-121™
Stratagene recommends titering adeno-associated recombinant virus stocks using the AAV-HT1080 cells, a human fibrosarcoma cell line. Stratagene has found the AAV-HT1080 cells to be more permissible to AAV infection than other cells lines, such as 293 cells, and thus able to give more accurate viral titers. In addition, AAV titering protocols using AAV-HT1080 cells have been optimized and are provided in Stratagene’s AAV-Helper Free System Instruction Manual (Catalog #240071).

recombinant Adeno-associated Virus (rAAV)

Level 1 [http://www.bvl.bund.de/SharedDocs/Downloads/06_Gentechnik/register_datenbanken/organismenliste.pdf?__blob=publicationFile&v=4 German Federal Office for Consumer Protection and Food Safety]
The Biological Safety Level (BSL) classifications for AAVs are:

• Adeno-associated Virus 2, 3 and 5 have to be handled under BSL 1.
  
• Adeno-associated Virus 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10 and 11 have to be handled under BSL 2.
  

This classification was developed based on the fact that only serotypes 2, 3 and 5 are isolated from humans and that their harmlessness has been confirmed in clinical studies. This general classification has to be revised when the virus contains gene sequences with a transforming potential.

Viral vector systems include a vector plasmid that only contains the viral Inverted Terminal Repeats (ITRs) and the genes for Rep and Cap in trans (as in the case of our project). So our virus can be classified as BSL 1 if the following conditions are fulfilled:

• The viral particles do not contain AAV derived sequences other than the ITRs
  
• The viral particles do not contain nucleotide sequences with a risk potential
  

Due to the fact that we work with AAV-2 and we fulfill the conditions stated above, it can be handled under BSL1.

E. coli ER2738

Level: 1 [http://fehlt German Federal Office for Consumer Protection and Food Safety]
genotype: F´proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)/ fhuA2 glnV Δ(lac-proAB) thi-1 Δ(hsdS-mcrB)5
E. coli with plasmid for F-pillus, used for phage display.

phages M13

Level: 1 [http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=15669-B1&Template=bacteriophages ATCC® Number: 15669-B1™ ]
Safety issues concerning phages:
Even though the phage type that we used is commonly used in laboratories, it requires an extra working bench. Phages are robust organisms that infect pilli bacteria. Therefore, they are not pathogenic for humans and do not cause any risk for people. Nevertheless, while working with phages one has to be careful not to get any phage contamination to other bacterial strains present in the lab.

Appendix

Technical safety requirements for BSL 1 laboratories in Germany according to GenTSV appendix III

(this is posted due to an e-mail of the safety judges requesting a description of the laboratory safety standards; we adhere to all listed standards and the laboratory is controlled about twice a year.)

Anhang III Sicherheitsmaßnahmen für Labor- und Produktionsbereich; Fundstelle des Originaltextes: BGBl. I 1995, 311 - 315; bzgl. der einzelnen Änderungen vgl. Fußnote

A. Sicherheitsmaßnahmen für den Laborbereich. Die Anforderungen der niedrigen Stufen sind von den höheren eingeschlossen. I. Stufe

1. Der Gentechnik-Arbeitsbereich ist als solcher und entsprechend der Sicherheitsstufe der gentechnischen Arbeiten, für die er zugelassen ist, zu kennzeichnen.

2. Die Arbeiten sollen in abgegrenzten und in ausreichend großen Räumen bzw. Bereichen durchgeführt werden. In Abhängigkeit von der Tätigkeit ist eine ausreichende Arbeitsfläche für jeden Mitarbeiter zu gewährleisten.

3. Oberflächen (Arbeitsflächen sowie die an die Arbeitsflächen angrenzenden Wandflächen und Fußböden) sollen leicht zu reinigen und müssen dicht und beständig gegen die verwendeten Stoffe und Reinigungsmittel sein.

4. Ein Waschbecken soll im Arbeitsbereich vorhanden sein.

5. Türen der Arbeitsräume sollen während der Arbeiten geschlossen sein. Labortüren sollen nach außen aufschlagen und sollen aus Gründen des Personenschutzes Sichtfenster aufweisen.

6. Mundpipettieren ist untersagt, Pipettierhilfen sind zu benutzen.

7. Spritzen und Kanülen sollen nur wenn unbedingt nötig benutzt werden.

8. Bei allen Arbeiten muß darauf geachtet werden, dass Aerosolbildung so weit wie möglich vermieden wird. Bei Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 1 mit sensibilisierenden oder toxischen Wirkungen sind entsprechende Maßnahmen zu treffen, die eine Exposition der Beschäftigten minimieren. Hier kann es sich z. B. um die Verwendung einer Sicherheitswerkbank, den Einsatz von Atemschutz oder die Vermeidung sporenbildender Entwicklungsphasen bei Pilzen handeln.

9. Nach Beendigung der Tätigkeit und vor Verlassen des Arbeitsbereiches müssen die Hände ggf. desinfiziert, sorgfältig gewaschen, und rückgefettet (Hautschutzplan) werden.

10. Laborräume sollen aufgeräumt und saubergehalten werden. Auf den Arbeitstischen sollen nur die tatsächlich benötigten Geräte und Materialien stehen. Vorräte sollen nur in dafür bereitgestellten Räumen oder Schränken gelagert werden.

11. Die Identität und Reinheit der benutzten Organismen ist regelmäßig zu überprüfen, wenn dies für die Beurteilung des Gefährdungspotentials notwendig ist. Die zeitlichen Abstände richten sich nach dem möglichen Gefährdungspotential.

12. Die Aufbewahrung der gentechnisch veränderten Organismen hat sachgerecht zu erfolgen.

13. Ungeziefer und Überträger von GVO (z. B. Nagetiere und Arthropoden) sind in geeigneter Weise zu bekämpfen, sofern erforderlich.

14. Verletzungen sind dem Projektleiter unverzüglich zu melden.

15. Nahrungs- und Genußmittel sowie Kosmetika dürfen im Arbeitsbereich nicht aufbewahrt werden.

16. In Arbeitsräumen darf nicht gegessen, getrunken, geraucht, geschnupft oder geschminkt werden. Für die Beschäftigten sind Bereiche einzurichten, in denen sie ohne Beeinträchtigung ihrer Gesundheit durch gentechnisch veränderte Organismen essen, trinken, rauchen oder schnupfen können.

17. In Arbeitsräumen sind Laborkittel oder andere Schutzkleidung zu tragen.

18. Ein Autoklav muss innerhalb des Betriebsgeländes vorhanden sein.

19. Erforderlichenfalls ist außerhalb der primären physikalischen Einschließung auf das Vorhandensein lebensfähiger, in der Anwendung eingesetzter Organismen zu prüfen.

20. Für den Fall des Austretens von GVO müssen wirksame Desinfektionsmittel und spezifische Desinfektionsverfahren zur Verfügung stehen.