Team:TU Munich/Notebook/Protocols

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{{Team:TU_Munich/Header}}
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= Protocols =
iGEM 2012: Protokolle für Standard-­Methoden (Simon Heinze)
iGEM 2012: Protokolle für Standard-­Methoden (Simon Heinze)
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Mit Qiagen Plasmid Kit. Beachten des zusätzlichen Waschschritts für endA+ Stämme (siehe Protokoll). Achtung beim Lysieren! Nur 1-­‐2 mal invertieren und auf keinen Fall länger als 5 Minuten inkubieren. Neutralisieren sobald die Zellen lysiert sind (sieht man an der Viskosität der Probe).
Mit Qiagen Plasmid Kit. Beachten des zusätzlichen Waschschritts für endA+ Stämme (siehe Protokoll). Achtung beim Lysieren! Nur 1-­‐2 mal invertieren und auf keinen Fall länger als 5 Minuten inkubieren. Neutralisieren sobald die Zellen lysiert sind (sieht man an der Viskosität der Probe).
Agarose-­Gelelektrophorese (DNA)
Agarose-­Gelelektrophorese (DNA)
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Die Kammern & Schlitten aus den rechten Behältern sind besser, dazu gehören die weißen Kämme
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* Die Kammern & Schlitten aus den rechten Behältern sind besser, dazu gehören die weißen Kämme
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8er und 12er Kämme: maximal 20 μl je Taschegut für analytische Gele. Von den 8er Kämmen gibt es dickere und dünnere, die dünneren liefern die schönsten Banden
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* 8er und 12er Kämme: maximal 20 μl je Taschegut für analytische Gele. Von den 8er Kämmen gibt es dickere und dünnere, die dünneren liefern die schönsten Banden
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Große Kämme (2er): maximal 50 μl je Tasche  gut für präparative Gele.
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* Große Kämme (2er): maximal 50 μl je Tasche  gut für präparative Gele.
Vorgehen für 1%-­‐Agarosegele (bei kleinen DNA-­‐Fragmenten muss man u.U. ein höher-­‐prozentiges
Vorgehen für 1%-­‐Agarosegele (bei kleinen DNA-­‐Fragmenten muss man u.U. ein höher-­‐prozentiges
Gel verwenden!):
Gel verwenden!):
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Schlitten in Kammer einsetzen, darauf achten dass es dicht abschließt.
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* Schlitten in Kammer einsetzen, darauf achten dass es dicht abschließt.
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In 100 ml Erlenmeyerkolben mit weitem Hals 0,6 g Agarose einwiegen
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* In 100 ml Erlenmeyerkolben mit weitem Hals 0,6 g Agarose einwiegen
o „Universal-­‐Agarose“ für analytische Gele verwenden
o „Universal-­‐Agarose“ für analytische Gele verwenden
o „L.M.P-­‐Agarose“ (= low melting point) für präparative Gele verwenden
o „L.M.P-­‐Agarose“ (= low melting point) für präparative Gele verwenden
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Zugabe von 60 ml 1x TAE-­‐Puffer
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* Zugabe von 60 ml 1x TAE-­‐Puffer
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In der Mikrowelle aufkochen (ca. 1-­‐2 Minuten, 600 – 750 Watt), mehrmals schwenken,
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* In der Mikrowelle aufkochen (ca. 1-­‐2 Minuten, 600 – 750 Watt), mehrmals schwenken,
aufpassen, dass es nicht überkocht! Solange kochen/schwenken, bis alle Schlieren & Partikel
aufpassen, dass es nicht überkocht! Solange kochen/schwenken, bis alle Schlieren & Partikel
aufgelöst sind
aufgelöst sind
-
Unter fließendem Wasser den Kolben von außen kühlen (handwarm, Ethidiumbromid ist
+
* Unter fließendem Wasser den Kolben von außen kühlen (handwarm, Ethidiumbromid ist
temperaturempfindlich!)
temperaturempfindlich!)
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Gel in den Schlitten / Kammer einfüllen, dabei Ethidiumbromid dazupipettieren. Dazu die am
+
* Gel in den Schlitten / Kammer einfüllen, dabei Ethidiumbromid dazupipettieren. Dazu die am
Arbeitsplatz befindliche Pipette verwenden (gelbe Spitzen verwenden, die Pipette ist auf ca. 3 μl eingestellt, dies ist die richtige Menge EtBr). Das EtBr im Gel gleichmäßig verteilen, indem man mit der Pipettenspitze „in X-­‐ und Y-­‐Richtung“ durch das Gel streicht, bis keine roten Wölkchen mehr sichtbar sind. Luftblasen ggf. mit Pipettenspitze zerstechen oder an den unteren Rand des Gels schieben.
Arbeitsplatz befindliche Pipette verwenden (gelbe Spitzen verwenden, die Pipette ist auf ca. 3 μl eingestellt, dies ist die richtige Menge EtBr). Das EtBr im Gel gleichmäßig verteilen, indem man mit der Pipettenspitze „in X-­‐ und Y-­‐Richtung“ durch das Gel streicht, bis keine roten Wölkchen mehr sichtbar sind. Luftblasen ggf. mit Pipettenspitze zerstechen oder an den unteren Rand des Gels schieben.
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Kamm ins Gel einsetzen (gerade!), Gel aushärten lassen (Dauer: ca. 30 min)
+
* Kamm ins Gel einsetzen (gerade!), Gel aushärten lassen (Dauer: ca. 30 min)
-
Präparative Gele mit etwas Puffer überschichten und in einen „Autoklavierbeutel“ stellen,
+
* Präparative Gele mit etwas Puffer überschichten und in einen „Autoklavierbeutel“ stellen,
das ganze 30 min im Kühlschrank aufbewahren (sonst wird das Gel bei der Elektrophorese zu
das ganze 30 min im Kühlschrank aufbewahren (sonst wird das Gel bei der Elektrophorese zu
weich)
weich)
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Gel samt Schlitten aus der Kammer nehmen und in Elektrophoreseapparatur einsetzen, mit
+
* Gel samt Schlitten aus der Kammer nehmen und in Elektrophoreseapparatur einsetzen, mit
1x TAE Puffer auffüllen, bis das Gel überschichtet ist.
1x TAE Puffer auffüllen, bis das Gel überschichtet ist.
-
Proben entsprechend mit Ladepuffer vermischen und in die Kammern pipettieren. Vom
+
* Proben entsprechend mit Ladepuffer vermischen und in die Kammern pipettieren. Vom
Marker 6 μl verwenden.
Marker 6 μl verwenden.
-
Deckel auf die Apparatur setzen (DNA ist negativ geladen, läuft also von Minus nach Plus
+
* Deckel auf die Apparatur setzen (DNA ist negativ geladen, läuft also von Minus nach Plus
Der Minus-­‐Anschluss muss oben sein, der Plus-­‐Anschluss unten)
Der Minus-­‐Anschluss muss oben sein, der Plus-­‐Anschluss unten)
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Elektrophorese:
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* Elektrophorese:
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o Analytische Gele: 1 Stunde bei 90 Volt (bei sehr großen Fragmenten (ab ca. 6 kb) ggf. Länger)
o Analytische Gele: 1 Stunde bei 90 Volt (bei sehr großen Fragmenten (ab ca. 6 kb) ggf. Länger)
o Präparative Gele: 90 min bei 70 Volt
o Präparative Gele: 90 min bei 70 Volt
-
Gel zum Anschauen ins Photolabor bringen, zum Transport Gel samt Schlitten in eine der
+
* Gel zum Anschauen ins Photolabor bringen, zum Transport Gel samt Schlitten in eine der
dafür gedachten Wannen stellen
dafür gedachten Wannen stellen
-
Gelfoto machen und bei präp. Gelen die gewünschten Banden ausschneiden & DNA reinigen
+
* Gelfoto machen und bei präp. Gelen die gewünschten Banden ausschneiden & DNA reinigen
Herstellung CaCl2-­kompetenter E. coli-­ Zellen
Herstellung CaCl2-­kompetenter E. coli-­ Zellen
Generell zu beachten: Zellen ab dem ersten Zentrifugationsschritt immer auf Eis/kalt aufbewahren! Steril arbeiten! Wer kompetente Zellen macht hat gegenüber Leuten die Proteine konzentrieren etc. an den Zentrifugen Vorrang (ggf. nett und höflich fragen, wer gerade die Zentrifuge verwendet, wenn beide Zentrifugen besetzt sein sollten).
Generell zu beachten: Zellen ab dem ersten Zentrifugationsschritt immer auf Eis/kalt aufbewahren! Steril arbeiten! Wer kompetente Zellen macht hat gegenüber Leuten die Proteine konzentrieren etc. an den Zentrifugen Vorrang (ggf. nett und höflich fragen, wer gerade die Zentrifuge verwendet, wenn beide Zentrifugen besetzt sein sollten).
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Benötigte Lösungen:
+
* Benötigte Lösungen:
o 0,1 M MgCl2-­‐Lösung, steril
o 0,1 M MgCl2-­‐Lösung, steril
o 0,05 M CaCl2-­‐Lösung, steril
o 0,05 M CaCl2-­‐Lösung, steril
o 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin, steril
o 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin, steril
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4 ml ÜN-­‐Kultur der gewünschten Zellen ansetzen (in Kulturröhrchen)
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* 4 ml ÜN-­‐Kultur der gewünschten Zellen ansetzen (in Kulturröhrchen)
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Von der ÜN-­‐Kultur 500 μl Suspension zum Animpfen von 50 ml LB-­‐Medium (ohne
+
* Von der ÜN-­‐Kultur 500 μl Suspension zum Animpfen von 50 ml LB-­‐Medium (ohne
Antibiotikum) verwenden. Inkubation: 37 °C, 180 rpm. Regelmäßig OD550 messen.
Antibiotikum) verwenden. Inkubation: 37 °C, 180 rpm. Regelmäßig OD550 messen.
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Lösungen kaltstellen
+
* Lösungen kaltstellen
-
Bei OD550 = 0,5: Überführen der Kultur in ein 50 ml Falcon-­‐Tube
+
* Bei OD550 = 0,5: Überführen der Kultur in ein 50 ml Falcon-­‐Tube
-
Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
+
* Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
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Überstand verwerfen, Zellpellet in 40 ml kalter 0,1 M MgCl2-­‐Lsg. resuspendieren
+
* Überstand verwerfen, Zellpellet in 40 ml kalter 0,1 M MgCl2-­‐Lsg. resuspendieren
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Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
+
* Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
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Überstand verwerfen, Zellpellet in 20 ml kalter 0,05 M CaCl2-­‐Lsg. resuspendieren
+
* Überstand verwerfen, Zellpellet in 20 ml kalter 0,05 M CaCl2-­‐Lsg. resuspendieren
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Inkubation: 30 min auf Eis
+
* Inkubation: 30 min auf Eis
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Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
+
* Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
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Überstand verwerfen, Pellet in 2 ml 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin resuspendieren
+
* Überstand verwerfen, Pellet in 2 ml 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin resuspendieren
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Aliquotieren (z.b. 100 μl oder 200 μl je Eppi)
+
* Aliquotieren (z.b. 100 μl oder 200 μl je Eppi)
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Aufbewahren bei – 80 °C
+
* Aufbewahren bei – 80 °C
PCR (mit Taq-­Polymerase)
PCR (mit Taq-­Polymerase)
-
Ansatz in ein 0,5 ml Eppi-­‐Tube pipettieren:
+
* Ansatz in ein 0,5 ml Eppi-­‐Tube pipettieren:
o 5 μl 10x Taq-­‐Puffer mit (NH4)2SO4
o 5 μl 10x Taq-­‐Puffer mit (NH4)2SO4
o 3μl25mMMgCl2
o 3μl25mMMgCl2
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o dNTP-­‐Mix: Bei c = 25 mM: 0,4 μl verwenden, bei c = 2,5 mM: 4 μl verwenden o wird erst später zugegeben: 0,3 μl Taq-­‐DNA-­‐Polymerase
o dNTP-­‐Mix: Bei c = 25 mM: 0,4 μl verwenden, bei c = 2,5 mM: 4 μl verwenden o wird erst später zugegeben: 0,3 μl Taq-­‐DNA-­‐Polymerase
o Mit sterilem ddH2O auf 50 μl auffüllen
o Mit sterilem ddH2O auf 50 μl auffüllen
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Temperaturprogramm (funktioniert bei zu amplifizierenden Fragmenten um 700 – 800 bp,
+
* Temperaturprogramm (funktioniert bei zu amplifizierenden Fragmenten um 700 – 800 bp,
bei anderen Längen sicherheitshalber nochmal jemand mit Ahnung fragen) im Thermocycler einprogrammieren und verwenden :
bei anderen Längen sicherheitshalber nochmal jemand mit Ahnung fragen) im Thermocycler einprogrammieren und verwenden :
o 1 min bei 94 °C (=Start)
o 1 min bei 94 °C (=Start)
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o Abschluss: 5 min bei 72 °C
o Abschluss: 5 min bei 72 °C
o Danach: 4 °C unbegrenzt
o Danach: 4 °C unbegrenzt
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5 μl des PCR-­‐Produkts mit DNA-­‐Auftragspuffer vermischen und ein analytisches Agarosegel
+
* 5 μl des PCR-­‐Produkts mit DNA-­‐Auftragspuffer vermischen und ein analytisches Agarosegel
machen, um zu kontrollieren, ob die PCR geklappt hat.
machen, um zu kontrollieren, ob die PCR geklappt hat.
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Wenn PCR erfolgreich (=korrekte Bande auf Gel): PCR Produkt mit PCR-­‐Purification Kit
+
* Wenn PCR erfolgreich (=korrekte Bande auf Gel): PCR Produkt mit PCR-­‐Purification Kit
(Qiagen) reinigen
(Qiagen) reinigen
Restriktionsverdau: präparativ und analytisch (= Kontrollverdau)
Restriktionsverdau: präparativ und analytisch (= Kontrollverdau)
Nach Möglichkeit „Mastermix“ aus Puffer, ddH2O (steril) und Restriktionsenzymen ansetzen, auf Tubes aufteilen und dann erst die jeweilige DNA dazugeben (z.B wenn mehrere verschiedene Plasmide / Miniprep-­‐Produkte mit dem gleichen Enzym / den gleichen Enzymen geschnitten werden sollen)
Nach Möglichkeit „Mastermix“ aus Puffer, ddH2O (steril) und Restriktionsenzymen ansetzen, auf Tubes aufteilen und dann erst die jeweilige DNA dazugeben (z.B wenn mehrere verschiedene Plasmide / Miniprep-­‐Produkte mit dem gleichen Enzym / den gleichen Enzymen geschnitten werden sollen)
Präparativer Verdau (für anschließende Ligierung)
Präparativer Verdau (für anschließende Ligierung)
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25 μl PCR-­‐Produkt oder 20 μl Plasmid (Miniprep) (=2-­‐10 μg DNA)
+
* 25 μl PCR-­‐Produkt oder 20 μl Plasmid (Miniprep) (=2-­‐10 μg DNA)
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20 u der jeweiligen Restriktionsenzyme (i.d.R. 2 μl je Enzym)
+
* 20 u der jeweiligen Restriktionsenzyme (i.d.R. 2 μl je Enzym)
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Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym
+
* Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym
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Gesamtvolumen (mit sterilem ddH2O einstellen): 50 μl (PCR-­‐Produkt) bzw. 40 μl (Plasmid)
+
* Gesamtvolumen (mit sterilem ddH2O einstellen): 50 μl (PCR-­‐Produkt) bzw. 40 μl (Plasmid)
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Inkubationsdauer: 2 bis 3 Stunden, 37 °C
+
* Inkubationsdauer: 2 bis 3 Stunden, 37 °C
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Anschließend: präparative Gelelektrophorese
+
* Anschließend: präparative Gelelektrophorese
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Produkt mit Gel Extraction Kit reinigen
+
* Produkt mit Gel Extraction Kit reinigen
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Zur Kontrolle der Reinigung und zum Abschätzen der Konzentrationen der gewonnenen,
+
* Zur Kontrolle der Reinigung und zum Abschätzen der Konzentrationen der gewonnenen,
geschnittenen DNA 5 μl der Proben über analytisches Gel laufen lassen, Konzentrationen der Proben anhand der Marker (hier ist immer vom Hersteller angegeben, wie viel ng DNA eine Bande des Markers enthält) abschätzen
geschnittenen DNA 5 μl der Proben über analytisches Gel laufen lassen, Konzentrationen der Proben anhand der Marker (hier ist immer vom Hersteller angegeben, wie viel ng DNA eine Bande des Markers enthält) abschätzen
Kontrollverdau
Kontrollverdau
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500 ng Plasmid (Miniprep), bzw. 2,5 μl einsetzen
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* 500 ng Plasmid (Miniprep), bzw. 2,5 μl einsetzen
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0, 25 μl je Enzym
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* 0, 25 μl je Enzym
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Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym
+
* Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym
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Gesamtvolumen mit sterilem ddH2O auf 20 μl einstellen
+
* Gesamtvolumen mit sterilem ddH2O auf 20 μl einstellen
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Inkubationsdauer: 1 bis 2 Stunden, 37 °C
+
* Inkubationsdauer: 1 bis 2 Stunden, 37 °C
Ligierung
Ligierung
Protokoll für 20 μl Ansatz (wenn 10 μl Ansatz gewünscht wird, einfach jeweils die Hälfte einsetzen)
Protokoll für 20 μl Ansatz (wenn 10 μl Ansatz gewünscht wird, einfach jeweils die Hälfte einsetzen)
-
100 ng geschnittenen Vektor (Konzentration bekannt, i.d.R. anhand analyt. Gel abgeschätzt), v=m/c
+
* 100 ng geschnittenen Vektor (Konzentration bekannt, i.d.R. anhand analyt. Gel abgeschätzt), v=m/c
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Insert: Molares Verhältnis Vektor/Insert sollte 1 / 3 betragen
+
* Insert: Molares Verhältnis Vektor/Insert sollte 1 / 3 betragen
-
o mInsert= 3 * mVektor * Längeinsert/Längevektor (Länge in bp)
+
** mInsert= 3 * mVektor * Längeinsert/Längevektor (Länge in bp)
-
o vinsert = minsert/cinsert
+
** vinsert = minsert/cinsert
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Negativ-­‐Kontrolle nicht vergessen! Hier statt Insert steriles ddH2O einsetzen
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* Negativ-­‐Kontrolle nicht vergessen! Hier statt Insert steriles ddH2O einsetzen
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T4-­‐Ligase-­‐Puffer (Menge je nach Angaben, Puffer schonend aber gründlich auftauen!)
+
* T4-­‐Ligase-­‐Puffer (Menge je nach Angaben, Puffer schonend aber gründlich auftauen!)
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0,5 μl T4-­‐DNA-­‐Ligase
+
* 0,5 μl T4-­‐DNA-­‐Ligase
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Inkubation im 16 °C-­‐Wasserbad über Nacht (Nach 3 h kann man, wenn man es eilig hat,
+
* Inkubation im 16 °C-­‐Wasserbad über Nacht (Nach 3 h kann man, wenn man es eilig hat,
schon einen Teil des Ansatzes für die Transformation einsetzen, aber immer den Rest zur
schon einen Teil des Ansatzes für die Transformation einsetzen, aber immer den Rest zur
Sicherheit ÜN inkubieren).
Sicherheit ÜN inkubieren).
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Trafo in E. coli
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* Trafo in E. coli
Transformation Calcium-­kompetenter E. coli-­Zellen
Transformation Calcium-­kompetenter E. coli-­Zellen
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100 μl der kompetenten Zellen auf Eis auftauen
+
* 100 μl der kompetenten Zellen auf Eis auftauen
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Versetzen der Zellen mit 1 μl Plasmid einer Miniprep oder mit 5 μl eines
+
* Versetzen der Zellen mit 1 μl Plasmid einer Miniprep oder mit 5 μl eines
Ligierungsproduktes
Ligierungsproduktes
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Inkubation für 30 min auf Eis
+
* Inkubation für 30 min auf Eis
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Hitzeschock: 5 min bei 37 °C
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* Hitzeschock: 5 min bei 37 °C
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Zellen vollständig in 1 ml LB-­‐Medium ohne Antibiotikum überführen und bei 37 °C
+
* Zellen vollständig in 1 ml LB-­‐Medium ohne Antibiotikum überführen und bei 37 °C
und 180 rpm 30 min inkubieren (Bei Trafo von 2 Plasmiden (=Doppeltrafo) oder wenn mit einem anderen Antibiotikum als Ampicillin selektiert werden soll zur Sicherheit 45 min inkubieren)
und 180 rpm 30 min inkubieren (Bei Trafo von 2 Plasmiden (=Doppeltrafo) oder wenn mit einem anderen Antibiotikum als Ampicillin selektiert werden soll zur Sicherheit 45 min inkubieren)
-
Ausplattieren auf LB-­‐Agarplatten mit geeigneten Antibiotika
+
* Ausplattieren auf LB-­‐Agarplatten mit geeigneten Antibiotika
o 100 μl des inkubierten Ansatzes ausplattieren
o 100 μl des inkubierten Ansatzes ausplattieren
o Rest der Suspension in Mikrozentrifuge sedimentieren (30-­‐60 sec, 13000
o Rest der Suspension in Mikrozentrifuge sedimentieren (30-­‐60 sec, 13000
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Herstellung einer Ampicillin-­Stammlösung
Herstellung einer Ampicillin-­Stammlösung
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100 mg/ml in H2O (Ampicillin befindet sich im Zentrallabor im Kühlschrank)
+
* 100 mg/ml in H2O (Ampicillin befindet sich im Zentrallabor im Kühlschrank)
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Sterilfiltrieren
+
* Sterilfiltrieren
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Bei -­‐20 °C aufbewahren
+
* Bei -­‐20 °C aufbewahren
1:1000 zum Medium
1:1000 zum Medium
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Revision as of 12:39, 15 August 2012


Protocols

iGEM 2012: Protokolle für Standard-­Methoden (Simon Heinze) Plasmid Minipräp bei Expressionsstämmen (z.B. Bl21) Mit Qiagen Plasmid Kit. Beachten des zusätzlichen Waschschritts für endA+ Stämme (siehe Protokoll). Achtung beim Lysieren! Nur 1-­‐2 mal invertieren und auf keinen Fall länger als 5 Minuten inkubieren. Neutralisieren sobald die Zellen lysiert sind (sieht man an der Viskosität der Probe). Agarose-­Gelelektrophorese (DNA)

  • Die Kammern & Schlitten aus den rechten Behältern sind besser, dazu gehören die weißen Kämme
  • 8er und 12er Kämme: maximal 20 μl je Taschegut für analytische Gele. Von den 8er Kämmen gibt es dickere und dünnere, die dünneren liefern die schönsten Banden
  • Große Kämme (2er): maximal 50 μl je Tasche  gut für präparative Gele.

Vorgehen für 1%-­‐Agarosegele (bei kleinen DNA-­‐Fragmenten muss man u.U. ein höher-­‐prozentiges Gel verwenden!):

  • Schlitten in Kammer einsetzen, darauf achten dass es dicht abschließt.
  • In 100 ml Erlenmeyerkolben mit weitem Hals 0,6 g Agarose einwiegen

o „Universal-­‐Agarose“ für analytische Gele verwenden o „L.M.P-­‐Agarose“ (= low melting point) für präparative Gele verwenden

  • Zugabe von 60 ml 1x TAE-­‐Puffer
  • In der Mikrowelle aufkochen (ca. 1-­‐2 Minuten, 600 – 750 Watt), mehrmals schwenken,

aufpassen, dass es nicht überkocht! Solange kochen/schwenken, bis alle Schlieren & Partikel aufgelöst sind

  • Unter fließendem Wasser den Kolben von außen kühlen (handwarm, Ethidiumbromid ist

temperaturempfindlich!)

  • Gel in den Schlitten / Kammer einfüllen, dabei Ethidiumbromid dazupipettieren. Dazu die am

Arbeitsplatz befindliche Pipette verwenden (gelbe Spitzen verwenden, die Pipette ist auf ca. 3 μl eingestellt, dies ist die richtige Menge EtBr). Das EtBr im Gel gleichmäßig verteilen, indem man mit der Pipettenspitze „in X-­‐ und Y-­‐Richtung“ durch das Gel streicht, bis keine roten Wölkchen mehr sichtbar sind. Luftblasen ggf. mit Pipettenspitze zerstechen oder an den unteren Rand des Gels schieben.

  • Kamm ins Gel einsetzen (gerade!), Gel aushärten lassen (Dauer: ca. 30 min)
  • Präparative Gele mit etwas Puffer überschichten und in einen „Autoklavierbeutel“ stellen,

das ganze 30 min im Kühlschrank aufbewahren (sonst wird das Gel bei der Elektrophorese zu weich)

  • Gel samt Schlitten aus der Kammer nehmen und in Elektrophoreseapparatur einsetzen, mit

1x TAE Puffer auffüllen, bis das Gel überschichtet ist.

  • Proben entsprechend mit Ladepuffer vermischen und in die Kammern pipettieren. Vom

Marker 6 μl verwenden.

  • Deckel auf die Apparatur setzen (DNA ist negativ geladen, läuft also von Minus nach Plus

Der Minus-­‐Anschluss muss oben sein, der Plus-­‐Anschluss unten)

  • Elektrophorese:

Seite 1 von 5 o Analytische Gele: 1 Stunde bei 90 Volt (bei sehr großen Fragmenten (ab ca. 6 kb) ggf. Länger) o Präparative Gele: 90 min bei 70 Volt

  • Gel zum Anschauen ins Photolabor bringen, zum Transport Gel samt Schlitten in eine der

dafür gedachten Wannen stellen

  • Gelfoto machen und bei präp. Gelen die gewünschten Banden ausschneiden & DNA reinigen

Herstellung CaCl2-­kompetenter E. coli-­ Zellen Generell zu beachten: Zellen ab dem ersten Zentrifugationsschritt immer auf Eis/kalt aufbewahren! Steril arbeiten! Wer kompetente Zellen macht hat gegenüber Leuten die Proteine konzentrieren etc. an den Zentrifugen Vorrang (ggf. nett und höflich fragen, wer gerade die Zentrifuge verwendet, wenn beide Zentrifugen besetzt sein sollten).

  • Benötigte Lösungen:

o 0,1 M MgCl2-­‐Lösung, steril o 0,05 M CaCl2-­‐Lösung, steril o 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin, steril

  • 4 ml ÜN-­‐Kultur der gewünschten Zellen ansetzen (in Kulturröhrchen)
  • Von der ÜN-­‐Kultur 500 μl Suspension zum Animpfen von 50 ml LB-­‐Medium (ohne

Antibiotikum) verwenden. Inkubation: 37 °C, 180 rpm. Regelmäßig OD550 messen.

  • Lösungen kaltstellen
  • Bei OD550 = 0,5: Überführen der Kultur in ein 50 ml Falcon-­‐Tube
  • Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
  • Überstand verwerfen, Zellpellet in 40 ml kalter 0,1 M MgCl2-­‐Lsg. resuspendieren
  • Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
  • Überstand verwerfen, Zellpellet in 20 ml kalter 0,05 M CaCl2-­‐Lsg. resuspendieren
  • Inkubation: 30 min auf Eis
  • Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
  • Überstand verwerfen, Pellet in 2 ml 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin resuspendieren
  • Aliquotieren (z.b. 100 μl oder 200 μl je Eppi)
  • Aufbewahren bei – 80 °C

PCR (mit Taq-­Polymerase)

  • Ansatz in ein 0,5 ml Eppi-­‐Tube pipettieren:

o 5 μl 10x Taq-­‐Puffer mit (NH4)2SO4 o 3μl25mMMgCl2 o 1 μl des Template-­‐Plasmids (Miniprep-­‐Produkt) o 2,5 μl je Primer (Konzentration der Primer: 10 μM) o dNTP-­‐Mix: Bei c = 25 mM: 0,4 μl verwenden, bei c = 2,5 mM: 4 μl verwenden o wird erst später zugegeben: 0,3 μl Taq-­‐DNA-­‐Polymerase o Mit sterilem ddH2O auf 50 μl auffüllen

  • Temperaturprogramm (funktioniert bei zu amplifizierenden Fragmenten um 700 – 800 bp,

bei anderen Längen sicherheitshalber nochmal jemand mit Ahnung fragen) im Thermocycler einprogrammieren und verwenden : o 1 min bei 94 °C (=Start) o Pause: Enzym zugeben, gut mischen, Programm fortsetzen („Enter“) o Zyklen (insgesamt 30 Wiederholungen): Seite 2 von 5  1minbei94°C  1minbei62°C  1,5 min bei 72 °C o Abschluss: 5 min bei 72 °C o Danach: 4 °C unbegrenzt

  • 5 μl des PCR-­‐Produkts mit DNA-­‐Auftragspuffer vermischen und ein analytisches Agarosegel

machen, um zu kontrollieren, ob die PCR geklappt hat.

  • Wenn PCR erfolgreich (=korrekte Bande auf Gel): PCR Produkt mit PCR-­‐Purification Kit

(Qiagen) reinigen Restriktionsverdau: präparativ und analytisch (= Kontrollverdau) Nach Möglichkeit „Mastermix“ aus Puffer, ddH2O (steril) und Restriktionsenzymen ansetzen, auf Tubes aufteilen und dann erst die jeweilige DNA dazugeben (z.B wenn mehrere verschiedene Plasmide / Miniprep-­‐Produkte mit dem gleichen Enzym / den gleichen Enzymen geschnitten werden sollen) Präparativer Verdau (für anschließende Ligierung)

  • 25 μl PCR-­‐Produkt oder 20 μl Plasmid (Miniprep) (=2-­‐10 μg DNA)
  • 20 u der jeweiligen Restriktionsenzyme (i.d.R. 2 μl je Enzym)
  • Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym
  • Gesamtvolumen (mit sterilem ddH2O einstellen): 50 μl (PCR-­‐Produkt) bzw. 40 μl (Plasmid)
  • Inkubationsdauer: 2 bis 3 Stunden, 37 °C
  • Anschließend: präparative Gelelektrophorese
  • Produkt mit Gel Extraction Kit reinigen
  • Zur Kontrolle der Reinigung und zum Abschätzen der Konzentrationen der gewonnenen,

geschnittenen DNA 5 μl der Proben über analytisches Gel laufen lassen, Konzentrationen der Proben anhand der Marker (hier ist immer vom Hersteller angegeben, wie viel ng DNA eine Bande des Markers enthält) abschätzen Kontrollverdau

  • 500 ng Plasmid (Miniprep), bzw. 2,5 μl einsetzen
  • 0, 25 μl je Enzym
  • Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym
  • Gesamtvolumen mit sterilem ddH2O auf 20 μl einstellen
  • Inkubationsdauer: 1 bis 2 Stunden, 37 °C

Ligierung Protokoll für 20 μl Ansatz (wenn 10 μl Ansatz gewünscht wird, einfach jeweils die Hälfte einsetzen)

  • 100 ng geschnittenen Vektor (Konzentration bekannt, i.d.R. anhand analyt. Gel abgeschätzt), v=m/c
  • Insert: Molares Verhältnis Vektor/Insert sollte 1 / 3 betragen
    • mInsert= 3 * mVektor * Längeinsert/Längevektor (Länge in bp)
    • vinsert = minsert/cinsert
  • Negativ-­‐Kontrolle nicht vergessen! Hier statt Insert steriles ddH2O einsetzen
  • T4-­‐Ligase-­‐Puffer (Menge je nach Angaben, Puffer schonend aber gründlich auftauen!)

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  • 0,5 μl T4-­‐DNA-­‐Ligase
  • Inkubation im 16 °C-­‐Wasserbad über Nacht (Nach 3 h kann man, wenn man es eilig hat,

schon einen Teil des Ansatzes für die Transformation einsetzen, aber immer den Rest zur Sicherheit ÜN inkubieren).

  • Trafo in E. coli

Transformation Calcium-­kompetenter E. coli-­Zellen

  • 100 μl der kompetenten Zellen auf Eis auftauen
  • Versetzen der Zellen mit 1 μl Plasmid einer Miniprep oder mit 5 μl eines

Ligierungsproduktes

  • Inkubation für 30 min auf Eis
  • Hitzeschock: 5 min bei 37 °C
  • Zellen vollständig in 1 ml LB-­‐Medium ohne Antibiotikum überführen und bei 37 °C

und 180 rpm 30 min inkubieren (Bei Trafo von 2 Plasmiden (=Doppeltrafo) oder wenn mit einem anderen Antibiotikum als Ampicillin selektiert werden soll zur Sicherheit 45 min inkubieren)

  • Ausplattieren auf LB-­‐Agarplatten mit geeigneten Antibiotika

o 100 μl des inkubierten Ansatzes ausplattieren o Rest der Suspension in Mikrozentrifuge sedimentieren (30-­‐60 sec, 13000 rpm), in wenig Medium (ca. 100 μl) resuspendieren und ausplattieren Seite 4 von 5 Herstellung einer Ampicillin-­Stammlösung

  • 100 mg/ml in H2O (Ampicillin befindet sich im Zentrallabor im Kühlschrank)
  • Sterilfiltrieren
  • Bei -­‐20 °C aufbewahren

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