Team:TU Munich/Notebook/Protocols

From 2012.igem.org

(Difference between revisions)
(Created page with "{{Team:TU_Munich/Header}}")
Line 1: Line 1:
{{Team:TU_Munich/Header}}
{{Team:TU_Munich/Header}}
 +
 +
 +
iGEM 2012: Protokolle für Standard-­Methoden (Simon Heinze)
 +
Plasmid Minipräp bei Expressionsstämmen (z.B. Bl21)
 +
Mit Qiagen Plasmid Kit. Beachten des zusätzlichen Waschschritts für endA+ Stämme (siehe Protokoll). Achtung beim Lysieren! Nur 1-­‐2 mal invertieren und auf keinen Fall länger als 5 Minuten inkubieren. Neutralisieren sobald die Zellen lysiert sind (sieht man an der Viskosität der Probe).
 +
Agarose-­Gelelektrophorese (DNA)
 +
• Die Kammern & Schlitten aus den rechten Behältern sind besser, dazu gehören die weißen Kämme
 +
• 8er und 12er Kämme: maximal 20 μl je Taschegut für analytische Gele. Von den 8er Kämmen gibt es dickere und dünnere, die dünneren liefern die schönsten Banden
 +
• Große Kämme (2er): maximal 50 μl je Tasche  gut für präparative Gele.
 +
Vorgehen für 1%-­‐Agarosegele (bei kleinen DNA-­‐Fragmenten muss man u.U. ein höher-­‐prozentiges
 +
Gel verwenden!):
 +
• Schlitten in Kammer einsetzen, darauf achten dass es dicht abschließt.
 +
• In 100 ml Erlenmeyerkolben mit weitem Hals 0,6 g Agarose einwiegen
 +
o „Universal-­‐Agarose“ für analytische Gele verwenden
 +
o „L.M.P-­‐Agarose“ (= low melting point) für präparative Gele verwenden
 +
• Zugabe von 60 ml 1x TAE-­‐Puffer
 +
• In der Mikrowelle aufkochen (ca. 1-­‐2 Minuten, 600 – 750 Watt), mehrmals schwenken,
 +
aufpassen, dass es nicht überkocht! Solange kochen/schwenken, bis alle Schlieren & Partikel
 +
aufgelöst sind
 +
• Unter fließendem Wasser den Kolben von außen kühlen (handwarm, Ethidiumbromid ist
 +
temperaturempfindlich!)
 +
• Gel in den Schlitten / Kammer einfüllen, dabei Ethidiumbromid dazupipettieren. Dazu die am
 +
Arbeitsplatz befindliche Pipette verwenden (gelbe Spitzen verwenden, die Pipette ist auf ca. 3 μl eingestellt, dies ist die richtige Menge EtBr). Das EtBr im Gel gleichmäßig verteilen, indem man mit der Pipettenspitze „in X-­‐ und Y-­‐Richtung“ durch das Gel streicht, bis keine roten Wölkchen mehr sichtbar sind. Luftblasen ggf. mit Pipettenspitze zerstechen oder an den unteren Rand des Gels schieben.
 +
• Kamm ins Gel einsetzen (gerade!), Gel aushärten lassen (Dauer: ca. 30 min)
 +
• Präparative Gele mit etwas Puffer überschichten und in einen „Autoklavierbeutel“ stellen,
 +
das ganze 30 min im Kühlschrank aufbewahren (sonst wird das Gel bei der Elektrophorese zu
 +
weich)
 +
• Gel samt Schlitten aus der Kammer nehmen und in Elektrophoreseapparatur einsetzen, mit
 +
1x TAE Puffer auffüllen, bis das Gel überschichtet ist.
 +
• Proben entsprechend mit Ladepuffer vermischen und in die Kammern pipettieren. Vom
 +
Marker 6 μl verwenden.
 +
• Deckel auf die Apparatur setzen (DNA ist negativ geladen, läuft also von Minus nach Plus
 +
Der Minus-­‐Anschluss muss oben sein, der Plus-­‐Anschluss unten)
 +
• Elektrophorese:
 +
Seite 1 von 5
 +
o Analytische Gele: 1 Stunde bei 90 Volt (bei sehr großen Fragmenten (ab ca. 6 kb) ggf. Länger)
 +
o Präparative Gele: 90 min bei 70 Volt
 +
• Gel zum Anschauen ins Photolabor bringen, zum Transport Gel samt Schlitten in eine der
 +
dafür gedachten Wannen stellen
 +
• Gelfoto machen und bei präp. Gelen die gewünschten Banden ausschneiden & DNA reinigen
 +
Herstellung CaCl2-­kompetenter E. coli-­ Zellen
 +
Generell zu beachten: Zellen ab dem ersten Zentrifugationsschritt immer auf Eis/kalt aufbewahren! Steril arbeiten! Wer kompetente Zellen macht hat gegenüber Leuten die Proteine konzentrieren etc. an den Zentrifugen Vorrang (ggf. nett und höflich fragen, wer gerade die Zentrifuge verwendet, wenn beide Zentrifugen besetzt sein sollten).
 +
• Benötigte Lösungen:
 +
o 0,1 M MgCl2-­‐Lösung, steril
 +
o 0,05 M CaCl2-­‐Lösung, steril
 +
o 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin, steril
 +
• 4 ml ÜN-­‐Kultur der gewünschten Zellen ansetzen (in Kulturröhrchen)
 +
• Von der ÜN-­‐Kultur 500 μl Suspension zum Animpfen von 50 ml LB-­‐Medium (ohne
 +
Antibiotikum) verwenden. Inkubation: 37 °C, 180 rpm. Regelmäßig OD550 messen.
 +
• Lösungen kaltstellen
 +
• Bei OD550 = 0,5: Überführen der Kultur in ein 50 ml Falcon-­‐Tube
 +
• Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
 +
• Überstand verwerfen, Zellpellet in 40 ml kalter 0,1 M MgCl2-­‐Lsg. resuspendieren
 +
• Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
 +
• Überstand verwerfen, Zellpellet in 20 ml kalter 0,05 M CaCl2-­‐Lsg. resuspendieren
 +
• Inkubation: 30 min auf Eis
 +
• Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!)
 +
• Überstand verwerfen, Pellet in 2 ml 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin resuspendieren
 +
• Aliquotieren (z.b. 100 μl oder 200 μl je Eppi)
 +
• Aufbewahren bei – 80 °C
 +
PCR (mit Taq-­Polymerase)
 +
• Ansatz in ein 0,5 ml Eppi-­‐Tube pipettieren:
 +
o 5 μl 10x Taq-­‐Puffer mit (NH4)2SO4
 +
o 3μl25mMMgCl2
 +
o 1 μl des Template-­‐Plasmids (Miniprep-­‐Produkt)
 +
o 2,5 μl je Primer (Konzentration der Primer: 10 μM)
 +
o dNTP-­‐Mix: Bei c = 25 mM: 0,4 μl verwenden, bei c = 2,5 mM: 4 μl verwenden o wird erst später zugegeben: 0,3 μl Taq-­‐DNA-­‐Polymerase
 +
o Mit sterilem ddH2O auf 50 μl auffüllen
 +
• Temperaturprogramm (funktioniert bei zu amplifizierenden Fragmenten um 700 – 800 bp,
 +
bei anderen Längen sicherheitshalber nochmal jemand mit Ahnung fragen) im Thermocycler einprogrammieren und verwenden :
 +
o 1 min bei 94 °C (=Start)
 +
o Pause: Enzym zugeben, gut mischen, Programm fortsetzen („Enter“) o Zyklen (insgesamt 30 Wiederholungen):
 +
Seite 2 von 5
 +
 1minbei94°C
 +
 1minbei62°C
 +
 1,5 min bei 72 °C
 +
o Abschluss: 5 min bei 72 °C
 +
o Danach: 4 °C unbegrenzt
 +
• 5 μl des PCR-­‐Produkts mit DNA-­‐Auftragspuffer vermischen und ein analytisches Agarosegel
 +
machen, um zu kontrollieren, ob die PCR geklappt hat.
 +
• Wenn PCR erfolgreich (=korrekte Bande auf Gel): PCR Produkt mit PCR-­‐Purification Kit
 +
(Qiagen) reinigen
 +
Restriktionsverdau: präparativ und analytisch (= Kontrollverdau)
 +
Nach Möglichkeit „Mastermix“ aus Puffer, ddH2O (steril) und Restriktionsenzymen ansetzen, auf Tubes aufteilen und dann erst die jeweilige DNA dazugeben (z.B wenn mehrere verschiedene Plasmide / Miniprep-­‐Produkte mit dem gleichen Enzym / den gleichen Enzymen geschnitten werden sollen)
 +
Präparativer Verdau (für anschließende Ligierung)
 +
• 25 μl PCR-­‐Produkt oder 20 μl Plasmid (Miniprep) (=2-­‐10 μg DNA)
 +
• 20 u der jeweiligen Restriktionsenzyme (i.d.R. 2 μl je Enzym)
 +
• Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym
 +
• Gesamtvolumen (mit sterilem ddH2O einstellen): 50 μl (PCR-­‐Produkt) bzw. 40 μl (Plasmid)
 +
• Inkubationsdauer: 2 bis 3 Stunden, 37 °C
 +
• Anschließend: präparative Gelelektrophorese
 +
• Produkt mit Gel Extraction Kit reinigen
 +
• Zur Kontrolle der Reinigung und zum Abschätzen der Konzentrationen der gewonnenen,
 +
geschnittenen DNA 5 μl der Proben über analytisches Gel laufen lassen, Konzentrationen der Proben anhand der Marker (hier ist immer vom Hersteller angegeben, wie viel ng DNA eine Bande des Markers enthält) abschätzen
 +
Kontrollverdau
 +
• 500 ng Plasmid (Miniprep), bzw. 2,5 μl einsetzen
 +
• 0, 25 μl je Enzym
 +
• Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym
 +
• Gesamtvolumen mit sterilem ddH2O auf 20 μl einstellen
 +
• Inkubationsdauer: 1 bis 2 Stunden, 37 °C
 +
Ligierung
 +
Protokoll für 20 μl Ansatz (wenn 10 μl Ansatz gewünscht wird, einfach jeweils die Hälfte einsetzen)
 +
• 100 ng geschnittenen Vektor (Konzentration bekannt, i.d.R. anhand analyt. Gel abgeschätzt), v=m/c
 +
• Insert: Molares Verhältnis Vektor/Insert sollte 1 / 3 betragen
 +
o mInsert= 3 * mVektor * Längeinsert/Längevektor (Länge in bp)
 +
o vinsert = minsert/cinsert
 +
• Negativ-­‐Kontrolle nicht vergessen! Hier statt Insert steriles ddH2O einsetzen
 +
• T4-­‐Ligase-­‐Puffer (Menge je nach Angaben, Puffer schonend aber gründlich auftauen!)
 +
Seite 3 von 5
 +

 +
• 0,5 μl T4-­‐DNA-­‐Ligase
 +
• Inkubation im 16 °C-­‐Wasserbad über Nacht (Nach 3 h kann man, wenn man es eilig hat,
 +
schon einen Teil des Ansatzes für die Transformation einsetzen, aber immer den Rest zur
 +
Sicherheit ÜN inkubieren).
 +
• Trafo in E. coli
 +
Transformation Calcium-­kompetenter E. coli-­Zellen
 +
• 100 μl der kompetenten Zellen auf Eis auftauen
 +
• Versetzen der Zellen mit 1 μl Plasmid einer Miniprep oder mit 5 μl eines
 +
Ligierungsproduktes
 +
• Inkubation für 30 min auf Eis
 +
• Hitzeschock: 5 min bei 37 °C
 +
• Zellen vollständig in 1 ml LB-­‐Medium ohne Antibiotikum überführen und bei 37 °C
 +
und 180 rpm 30 min inkubieren (Bei Trafo von 2 Plasmiden (=Doppeltrafo) oder wenn mit einem anderen Antibiotikum als Ampicillin selektiert werden soll zur Sicherheit 45 min inkubieren)
 +
• Ausplattieren auf LB-­‐Agarplatten mit geeigneten Antibiotika
 +
o 100 μl des inkubierten Ansatzes ausplattieren
 +
o Rest der Suspension in Mikrozentrifuge sedimentieren (30-­‐60 sec, 13000
 +
rpm), in wenig Medium (ca. 100 μl) resuspendieren und ausplattieren
 +
Seite 4 von 5
 +
Herstellung einer Ampicillin-­Stammlösung
 +
• 100 mg/ml in H2O (Ampicillin befindet sich im Zentrallabor im Kühlschrank)
 +
• Sterilfiltrieren
 +
• Bei -­‐20 °C aufbewahren
 +
1:1000 zum Medium
 +
Seite 5 von 5

Revision as of 11:47, 15 August 2012



iGEM 2012: Protokolle für Standard-­Methoden (Simon Heinze) Plasmid Minipräp bei Expressionsstämmen (z.B. Bl21) Mit Qiagen Plasmid Kit. Beachten des zusätzlichen Waschschritts für endA+ Stämme (siehe Protokoll). Achtung beim Lysieren! Nur 1-­‐2 mal invertieren und auf keinen Fall länger als 5 Minuten inkubieren. Neutralisieren sobald die Zellen lysiert sind (sieht man an der Viskosität der Probe). Agarose-­Gelelektrophorese (DNA) • Die Kammern & Schlitten aus den rechten Behältern sind besser, dazu gehören die weißen Kämme • 8er und 12er Kämme: maximal 20 μl je Taschegut für analytische Gele. Von den 8er Kämmen gibt es dickere und dünnere, die dünneren liefern die schönsten Banden • Große Kämme (2er): maximal 50 μl je Tasche  gut für präparative Gele. Vorgehen für 1%-­‐Agarosegele (bei kleinen DNA-­‐Fragmenten muss man u.U. ein höher-­‐prozentiges Gel verwenden!): • Schlitten in Kammer einsetzen, darauf achten dass es dicht abschließt. • In 100 ml Erlenmeyerkolben mit weitem Hals 0,6 g Agarose einwiegen o „Universal-­‐Agarose“ für analytische Gele verwenden o „L.M.P-­‐Agarose“ (= low melting point) für präparative Gele verwenden • Zugabe von 60 ml 1x TAE-­‐Puffer • In der Mikrowelle aufkochen (ca. 1-­‐2 Minuten, 600 – 750 Watt), mehrmals schwenken, aufpassen, dass es nicht überkocht! Solange kochen/schwenken, bis alle Schlieren & Partikel aufgelöst sind • Unter fließendem Wasser den Kolben von außen kühlen (handwarm, Ethidiumbromid ist temperaturempfindlich!) • Gel in den Schlitten / Kammer einfüllen, dabei Ethidiumbromid dazupipettieren. Dazu die am Arbeitsplatz befindliche Pipette verwenden (gelbe Spitzen verwenden, die Pipette ist auf ca. 3 μl eingestellt, dies ist die richtige Menge EtBr). Das EtBr im Gel gleichmäßig verteilen, indem man mit der Pipettenspitze „in X-­‐ und Y-­‐Richtung“ durch das Gel streicht, bis keine roten Wölkchen mehr sichtbar sind. Luftblasen ggf. mit Pipettenspitze zerstechen oder an den unteren Rand des Gels schieben. • Kamm ins Gel einsetzen (gerade!), Gel aushärten lassen (Dauer: ca. 30 min) • Präparative Gele mit etwas Puffer überschichten und in einen „Autoklavierbeutel“ stellen, das ganze 30 min im Kühlschrank aufbewahren (sonst wird das Gel bei der Elektrophorese zu weich) • Gel samt Schlitten aus der Kammer nehmen und in Elektrophoreseapparatur einsetzen, mit 1x TAE Puffer auffüllen, bis das Gel überschichtet ist. • Proben entsprechend mit Ladepuffer vermischen und in die Kammern pipettieren. Vom Marker 6 μl verwenden. • Deckel auf die Apparatur setzen (DNA ist negativ geladen, läuft also von Minus nach Plus Der Minus-­‐Anschluss muss oben sein, der Plus-­‐Anschluss unten) • Elektrophorese: Seite 1 von 5 o Analytische Gele: 1 Stunde bei 90 Volt (bei sehr großen Fragmenten (ab ca. 6 kb) ggf. Länger) o Präparative Gele: 90 min bei 70 Volt • Gel zum Anschauen ins Photolabor bringen, zum Transport Gel samt Schlitten in eine der dafür gedachten Wannen stellen • Gelfoto machen und bei präp. Gelen die gewünschten Banden ausschneiden & DNA reinigen Herstellung CaCl2-­kompetenter E. coli-­ Zellen Generell zu beachten: Zellen ab dem ersten Zentrifugationsschritt immer auf Eis/kalt aufbewahren! Steril arbeiten! Wer kompetente Zellen macht hat gegenüber Leuten die Proteine konzentrieren etc. an den Zentrifugen Vorrang (ggf. nett und höflich fragen, wer gerade die Zentrifuge verwendet, wenn beide Zentrifugen besetzt sein sollten). • Benötigte Lösungen: o 0,1 M MgCl2-­‐Lösung, steril o 0,05 M CaCl2-­‐Lösung, steril o 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin, steril • 4 ml ÜN-­‐Kultur der gewünschten Zellen ansetzen (in Kulturröhrchen) • Von der ÜN-­‐Kultur 500 μl Suspension zum Animpfen von 50 ml LB-­‐Medium (ohne Antibiotikum) verwenden. Inkubation: 37 °C, 180 rpm. Regelmäßig OD550 messen. • Lösungen kaltstellen • Bei OD550 = 0,5: Überführen der Kultur in ein 50 ml Falcon-­‐Tube • Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!) • Überstand verwerfen, Zellpellet in 40 ml kalter 0,1 M MgCl2-­‐Lsg. resuspendieren • Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!) • Überstand verwerfen, Zellpellet in 20 ml kalter 0,05 M CaCl2-­‐Lsg. resuspendieren • Inkubation: 30 min auf Eis • Zentrifugation bei 4 °C, 5000 g, 10 Minuten (Gegengewicht nicht vergessen!) • Überstand verwerfen, Pellet in 2 ml 0,05 M CaCl2, 15 % v/v Glycerin resuspendieren • Aliquotieren (z.b. 100 μl oder 200 μl je Eppi) • Aufbewahren bei – 80 °C PCR (mit Taq-­Polymerase) • Ansatz in ein 0,5 ml Eppi-­‐Tube pipettieren: o 5 μl 10x Taq-­‐Puffer mit (NH4)2SO4 o 3μl25mMMgCl2 o 1 μl des Template-­‐Plasmids (Miniprep-­‐Produkt) o 2,5 μl je Primer (Konzentration der Primer: 10 μM) o dNTP-­‐Mix: Bei c = 25 mM: 0,4 μl verwenden, bei c = 2,5 mM: 4 μl verwenden o wird erst später zugegeben: 0,3 μl Taq-­‐DNA-­‐Polymerase o Mit sterilem ddH2O auf 50 μl auffüllen • Temperaturprogramm (funktioniert bei zu amplifizierenden Fragmenten um 700 – 800 bp, bei anderen Längen sicherheitshalber nochmal jemand mit Ahnung fragen) im Thermocycler einprogrammieren und verwenden : o 1 min bei 94 °C (=Start) o Pause: Enzym zugeben, gut mischen, Programm fortsetzen („Enter“) o Zyklen (insgesamt 30 Wiederholungen): Seite 2 von 5  1minbei94°C  1minbei62°C  1,5 min bei 72 °C o Abschluss: 5 min bei 72 °C o Danach: 4 °C unbegrenzt • 5 μl des PCR-­‐Produkts mit DNA-­‐Auftragspuffer vermischen und ein analytisches Agarosegel machen, um zu kontrollieren, ob die PCR geklappt hat. • Wenn PCR erfolgreich (=korrekte Bande auf Gel): PCR Produkt mit PCR-­‐Purification Kit (Qiagen) reinigen Restriktionsverdau: präparativ und analytisch (= Kontrollverdau) Nach Möglichkeit „Mastermix“ aus Puffer, ddH2O (steril) und Restriktionsenzymen ansetzen, auf Tubes aufteilen und dann erst die jeweilige DNA dazugeben (z.B wenn mehrere verschiedene Plasmide / Miniprep-­‐Produkte mit dem gleichen Enzym / den gleichen Enzymen geschnitten werden sollen) Präparativer Verdau (für anschließende Ligierung) • 25 μl PCR-­‐Produkt oder 20 μl Plasmid (Miniprep) (=2-­‐10 μg DNA) • 20 u der jeweiligen Restriktionsenzyme (i.d.R. 2 μl je Enzym) • Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym • Gesamtvolumen (mit sterilem ddH2O einstellen): 50 μl (PCR-­‐Produkt) bzw. 40 μl (Plasmid) • Inkubationsdauer: 2 bis 3 Stunden, 37 °C • Anschließend: präparative Gelelektrophorese • Produkt mit Gel Extraction Kit reinigen • Zur Kontrolle der Reinigung und zum Abschätzen der Konzentrationen der gewonnenen, geschnittenen DNA 5 μl der Proben über analytisches Gel laufen lassen, Konzentrationen der Proben anhand der Marker (hier ist immer vom Hersteller angegeben, wie viel ng DNA eine Bande des Markers enthält) abschätzen Kontrollverdau • 500 ng Plasmid (Miniprep), bzw. 2,5 μl einsetzen • 0, 25 μl je Enzym • Puffer je nach Herstellerangaben passend zum Enzym • Gesamtvolumen mit sterilem ddH2O auf 20 μl einstellen • Inkubationsdauer: 1 bis 2 Stunden, 37 °C Ligierung Protokoll für 20 μl Ansatz (wenn 10 μl Ansatz gewünscht wird, einfach jeweils die Hälfte einsetzen) • 100 ng geschnittenen Vektor (Konzentration bekannt, i.d.R. anhand analyt. Gel abgeschätzt), v=m/c • Insert: Molares Verhältnis Vektor/Insert sollte 1 / 3 betragen o mInsert= 3 * mVektor * Längeinsert/Längevektor (Länge in bp) o vinsert = minsert/cinsert • Negativ-­‐Kontrolle nicht vergessen! Hier statt Insert steriles ddH2O einsetzen • T4-­‐Ligase-­‐Puffer (Menge je nach Angaben, Puffer schonend aber gründlich auftauen!) Seite 3 von 5  • 0,5 μl T4-­‐DNA-­‐Ligase • Inkubation im 16 °C-­‐Wasserbad über Nacht (Nach 3 h kann man, wenn man es eilig hat, schon einen Teil des Ansatzes für die Transformation einsetzen, aber immer den Rest zur Sicherheit ÜN inkubieren). • Trafo in E. coli Transformation Calcium-­kompetenter E. coli-­Zellen • 100 μl der kompetenten Zellen auf Eis auftauen • Versetzen der Zellen mit 1 μl Plasmid einer Miniprep oder mit 5 μl eines Ligierungsproduktes • Inkubation für 30 min auf Eis • Hitzeschock: 5 min bei 37 °C • Zellen vollständig in 1 ml LB-­‐Medium ohne Antibiotikum überführen und bei 37 °C und 180 rpm 30 min inkubieren (Bei Trafo von 2 Plasmiden (=Doppeltrafo) oder wenn mit einem anderen Antibiotikum als Ampicillin selektiert werden soll zur Sicherheit 45 min inkubieren) • Ausplattieren auf LB-­‐Agarplatten mit geeigneten Antibiotika o 100 μl des inkubierten Ansatzes ausplattieren o Rest der Suspension in Mikrozentrifuge sedimentieren (30-­‐60 sec, 13000 rpm), in wenig Medium (ca. 100 μl) resuspendieren und ausplattieren Seite 4 von 5 Herstellung einer Ampicillin-­Stammlösung • 100 mg/ml in H2O (Ampicillin befindet sich im Zentrallabor im Kühlschrank) • Sterilfiltrieren • Bei -­‐20 °C aufbewahren 1:1000 zum Medium Seite 5 von 5