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iGEM 2012 SEU_A Safety


Notebook

This is our experiment diary.

Index


Period 1 Biosafety


2012/04/05-2012/06/23 学习阶段:实验技能学习、实验理论学习,掌握从已有工程菌得到希望构建的工程菌的过程
设计从污水中分离培养蛭弧菌方案
Learning stage : Learn about the skill and theory of Molecular Biology Experiment. Set up the method of isolation and culture BD from sewage. 2012/04/05 LB培养基的制备、高压蒸汽灭菌锅的使用
LB medium preparation . Learn the usage of autoclaves. 细菌的培养 2012/04/06 利用BIOMIGA质粒小量提取试剂盒进行大肠杆菌质粒提取
2012/04/12 购买农业用蛭弧菌混合液,从中分离培养蛭弧菌
2012/04/14 蛭弧菌长出噬菌斑,分离纯化培养
2012/04/21 关于酶切、酶接相关实验技术学习
2012/05/18 2012年kit寄到,取kit进行转化,第一个转化I13521,命名“小红菌”
线性化质粒骨架酶切
2012/05/19 转化涂板技能练习
2012/05/20 挑单克隆,液体培养基振荡过夜培养
2012/05/22 PCR体系配置和技能练习
2012/05/23 优化酶接是骨架和片段的比例
2012/05/25 蛭弧菌菌液PCR,条带很弱,显示其生长不好或已变种
2012/06/13 所构建的工程菌保种

Period 2 Biosafety


Jun 26-Jul 12 整体方案敲定,如下所示: Death gene验证通路确定,如下: 蛭弧菌培养如火如荼
Sweet gene的钓取
2012/06/26 用小红菌作为营养物质培养异养型蛭弧菌
2012/06/28 K117010、I14032kit转化,构建工程菌,并设置对照实验验证其功能
2012/06/29 设置对照组,用活的&死的大肠杆菌培养蛭弧菌
2012/06/30 K117010功能验证实验
I14032质粒小提,凝胶回收
2012/07/01 0630阳性、阴性均未长菌,0628所转菌为假阳性
0630摇R0010质粒小提
2012/07/02 基因组分别钓取groES、groEL基因
通过PCR
2012/07/03 转化K117010、B0034、K117000涂板技术及使用菌液量改进
复苏小红菌
2012/07/04 K117010、B0034、K117000、R0010、B0015摇菌
2012/07/05 蛭弧菌双层琼脂培养基分开涂板,计算E.coli菌落扩散速率及蛭弧菌游动并捕食E.coli的速率
2012/07/06 蛭弧菌半定量PCR引物重新设计购买
2012/07/07 跟进蛭弧菌、小红菌菌斑扩增速率
2012/07/09 K117000、B0015双酶切
复苏K117000、K117010、B0034、R0010、B0015
2012/07/10 质粒小提K117000、K117010、B0034、R0010、B0015
K117000使用通用引物PCR,20ul体系
2012/07/11 质粒小提K117000、B0015
小红菌摇菌,用作蛭弧菌的食物
转化K117000,B0015
摇菌K117010、R0010、B0034、B0015. 2012/07/12 蛭弧菌菌液PCR验证
K117010、R0010、B0015菌液PCR
保种B0034、R0010、K117010、B0015,传代培养R0010、B0034、B0015
K117000挑单菌落,BL21摇菌
B0034、B0015酶切

Period 3 Biosafety


Jul 13--Jul 21 Conjugation支路的构建: 趋化性支路的构建: 成功钓取groE并含标准组件所需的酶切位点 2012/07/13 0712酶切体系跑胶回收
质粒小提B0034、B0015
R0010、B0034通用引物PCR
酶接体系配制R0010+B0034
转化酶接产物R0010+B0034,转化J01003、K117000
groES、groEL基因钓取
2012/07/14 J01003、R0010+B0034、K117000挑单菌落
2012/07/15 质粒小提K117000、J01003、R0010+B0034 K117000、J01003、R0010+B0034使用通用引物PCR
2012/07/16 R0010、K117010复苏
R0010+B0034菌液PCR
转化J01003
2012/07/17 R0010、K117010质粒小提 K117010、J01003、R0010+B0034质粒、R0010+B0034菌液、K117000 PCR
2012/07/18 J01003、K537001转化
自制感受态DH5α
2012/07/19 K117010、B0015、groEL、K117010(自主设计引物)
2012/07/20 groE基因钓取PCR
J01003质粒小提
R0010、K117010转化
图3.从基因组钓取的groE基因电泳图 (中间为D15000 Marker) 2012/07/21 R0010、K117010挑单菌落
R0010、K117010质粒小提
K537001转化
接合转移实验验证

Period 4 Biosafety


Jul 22-Aug 17 Death gene 验证通路构建成功
Conjugation通路构建成功,并将其连接至标准载体
Sweet gene表达载体的构建
2012/07/22 PCR退火最适温度实验探究
2012/07/23 转化J01001、R0084 0721接合转移菌株质粒检测
2012/07/24 K537001复苏摇菌
R0084、B0015挑单菌落
2012/07/25 半固体培养基配制
质粒小提J01001、R0084
K537001、R0084、J01001、groE菌液PCR
2012/07/26 K537001、K098011转化 2012/07/27 蛭弧菌涂板 2012/07/28 质粒小提R0010、K117010
菌液PCR R0010 2012/07/29 K537001、K098011挑单菌落
2012/07/30 菌液PCR groE/cheZ
复苏 R0084+B0034,送测序
2012/07/31 转化I13521、K117000、K098011
菌液PCR K117010、R0084+B0034、groE
质粒PCR K117010、R0084+B0034
质粒小提K098011、K117010、R0010、R0084+B0034
质粒小提电泳图 复苏R0010、 R0084、B0034 、K117010、K117000
双酶切R0010、K117010
2012/08/01 保种groES、B0034
双酶切R0084+B0034 、B0034 、K117000
双酶切电泳图 转化J04500
菌液PCR K117000、R0084、groE、R0010
2012/08/02 酶切回收R0084+B0034、B0034
菌液PCR K117000、R0084、K117010
质粒小提groES、B0034
保种K117000
双酶切R0084、B0034
J04500挑单菌落
酶接(R0084+B0034)+ K117000 、R0084+B0034、R0010+B0034
2012/08/03 质粒小提B0015、R0084、B0034、K117000、J04500
保种J04500
J04500、K117000质粒送测序
酶切回收R0084、B0034
双酶切R0084、B0034、J04500
酶接R0084+B0034
2012/08/04 酶切回收R0084、B0034、J04500
酶接R0084+B0034、J04500+ K117000
摇菌R0084、B0034、K117000
2012/08/05 质粒小提R0084、B0034、K117000
双酶切R0084、B0034、K117000
小红菌I13521 挑单菌落
复苏J01003、groES、PET
转化J01001
2012/08/06 菌液PCR groE
保种PET、I13521
酶接R0084+B0034、J04500+ K117000
质粒小提groES、J01003、PET32a、I13521
双酶切groE、J01003、pET32a、I13521
J01001挑单菌落
2012/08/07 质粒小提J01001、J04500、B0034
菌液PCR K117000、R0084、J01001
质粒PCR K117000、J01003
PCR产物回收K117000 双酶切J04500(S.P)、B0034(E.X)、K117000(X.P)、R0084(E.S)、 J01003(E.S)
转化R0084+B0034
2012/08/08 J01003+I13521、groE+pET32a酶接纯化
转化J01003+I13521、groE+pET32a
PCR J01003+I13521
复苏J04500、groES、pET32a、I13521、 R0084、B0034
保种R0084+B0034
2012/08/09 J01003+I13521 回收送测序 J01003+I13521、groE+pET32a挑单菌落
J04500、groES、pET32a、B0034质粒小提,凝胶回收
菌液PCR J01003+I13521、R0084、J01001、J01003
PCR产物回收J01003+I13521、R0084、J01001、J01003
双酶切J04500、groES、pET32a、B0034、K117000
双酶切电泳图 2012/08/10 0809的PCR产物点样 J01003+I13521、groE+pET32a菌液PCR验证,保种
pET32a保种
酶接J04500 +K117000、groES + pET32a
转化pSB1C3、J04500 +K117000、groES + pET32a
2012/08/11 pSB1C3、J04500 +K117000、groES + pET32a挑单菌落
J04500 +K117000、groES + pET32a酶接纯化
转化J04500 +K117000、groES + pET32a
菌液PCR J04500 +K117000
PCR产物回收J04500 +K117000
复苏B0015
2012/08/12 B0015质粒小提,凝胶回收
菌液PCR验证pSB1C3、J04500 +K117000、groES + pET32a
保种pSB1C3、J04500 +K117000、groES + pET32a
J04500 +K117000、groES + pET32a挑单菌落
2012/08/13 复苏B0034 重新转化pSB1C3 质粒小提(J04500+K117000)、菌液PCR用于酶切(J04500+K117000) 双酶切B0015、(J04500+K117000) 2012/08/14 挑单菌落pSB1C3 重新转化R0084 复苏(J01003+I13521) 0813双酶切回收 酶接体系(J04500+K117000)+B0015 2012/08/15 挑单菌落R0084 保种pSB1C3 质粒小提pSB1C3 菌液PCR用于酶切(J01003+I13521) 酶接回收,转化(J04500+K117000)+B0015 双酶切pSB1C3、(J01003+I13521) 2012/08/16 菌液PCR验证R0084 挑单菌落(J04500+K117000)+B0015 0815双酶切回收 酶接pSB1C3+(J01003+I13521) 复苏pSB1C3 2012/08/17 保种(J04500+K117000)+B0015 0816酶接回收,转化pSB1C3+(J01003+I13521) 质粒小提pSB1C3 菌液PCR用于酶切(J04500+K117000)+B0015 双酶切pSB1C3、(J04500+K117000)+B0015

Period 5 Biosafety


Aug 18-Sep 02 趋化性通路构建OK Sweet gene 验证开幕 Death gene验证开幕 Conjugation验证开幕 HSP promoter验证开幕 2012/08/18 复苏groE+pET32a、pET32a各一瓶 接着重新转化R0084 复苏pSB1C3、(J01003+I13521) 2012/08/19 挑单菌落R0084 Sweet gene验证实验Version 1.0(第一天) 质粒小提pSB1C3 菌液PCR用于酶切 (J01003+I13521) 双酶切pSB1C3、(J01003+I13521) 2012/08/20 菌液PCR验证R0084,送测序 Sweet gene验证实验Version 1.0(第二天) 含RP4质粒的HB101菌株寄到,复苏
0820酶切回收 酶接pSB1C3+(J01003+I13521) 复苏(J04500+K117000+B0015) 2012/08/21 保种HB101、R0084 Death gene验证实验version 1.0(第一天) 转化pSB1C3+(J01003+I13521) 复苏B0034、R0084 2012/08/22 菌液PCR用于酶切R0084 质粒小提B0034 挑单菌落pSB1C3+(J01003+I13521) Death gene验证实验version 1.0(第二天) 双酶切R0084、B0034 转化E0240 2012/08/23 0822酶切回收 菌液PCR验证pSB1C3+(J01003+I13521) 保种pSB1C3+(J01003+I13521) 质粒小提pSB1C3+(J01003+I13521) 酶接R0084+B0034 挑单菌落E0240 Promoter合成完成,复苏菌种 2012/08/24 酶接纯化,转化R0084+B0034 菌液PCR验证E0240 保种E0240 质粒小提E0240、HSP Promoter 双酶切E0240、HSP Promoter 复苏pSB1C3+(J01003+I13521)(BL21)、HB101、DH5α菌株 2012/08/25 0824酶切回收 挑单菌落R0084+B0034 Conjugation验证实验version 1.0(第一天) 酶接HSP promoter+E0240 复苏pSB1C3 2012/08/26 菌液PCR验证R0084+B0034 菌液PCR验证构建质粒是否成功 (所挑五个单克隆中,只有中间一个加上了目的片段) 保种R0084+B0034 菌液PCR用于酶切R0084+B0034(E& P)、cheZ(E&P)、cheZ(X&P) 从基因组钓取的cheZ基因 (第一泳道为D15000 Marker,第三至第八泳道为cheZ基因) 质粒小提pSB1C3(E&P)、R0084+B0034(S&P) Conjugation验证实验version 1.0(第二天) 酶接回收 转化HSP promoter+E0240 双酶切R0084+B0034(E& P)、cheZ(E&P)、cheZ(X&P)、pSB1C3(E&P)、R0084+B0034(S&P) 2012/08/27 0826酶切回收 酶接pSB1C3+(R0084+B0034)、pSB1C3+cheZ、(R0084+B0034)+ cheZ 挑单菌落HSP promoter+E0240 复苏pSB1C3、HSP promoter 2012/08/28 0827酶接回收 酶接转化pSB1C3+(R0084+B0034)、pSB1C3+cheZ、(R0084+B0034)+ cheZ 转化cheZ 菌液PCR验证HSP promoter+E0240 菌液PCR验证 (从Marker左数第二个为构建好的目的载体,左数第一个可能没有加上目的片段HSP promoter) 保种HSP promoter+E0240 质粒小提pSB1C3、HSP promoter 双酶切pSB1C3(E&P)、HSP promoter(E&P) 复苏pSB1C3+(J01003+I13521)(BL21)、HB101、DH5α菌株 2012/08/29 0828酶切回收pSB1C3(E&P)、HSP promoter(E&P) 挑单菌落pSB1C3+(R0084+B0034)、pSB1C3+cheZ、(R0084+B0034)+ cheZ 酶接pSB1C3+HSP promoter Conjugation验证实验version 2.0(第一天) 复苏B0015 2012/08/29 0828酶接回收 转化pSB1C3+HSP promoter 菌液PCR验证pSB1C3+(R0084+B0034)、pSB1C3+cheZ、(R0084+B0034)+ cheZ 保种pSB1C3+(R0084+B0034)、pSB1C3+cheZ、(R0084+B0034)+ cheZ 菌液PCR用于酶切(R0084+B0034)+ cheZ 质粒小提B0015、pSB1C3+(R0084+B0034)、pSB1C3+cheZ 双酶切(R0084+B0034)+ cheZ(E&S)、B0015(E&X) Conjugation验证实验version 2.0(第二天) 2012/08/30 挑单菌落pSB1C3+HSP promoter 酶切回收(R0084+B0034)+ cheZ(E&S)、B0015(E&X) 酶接(R0084+B0034+ cheZ)+B0015 2012/08/31 菌液PCR验证pSB1C3+HSP promoter 保种pSB1C3+HSP promoter 质粒小提pSB1C3+HSP promoter 酶接纯化(R0084+B0034+ cheZ)+B0015 转化(R0084+B0034+ cheZ)+B0015 复苏HSP promoter+E0240 2012/09/01 HSP promoter验证实验version 1.0(第一天) 挑单菌落(R0084+B0034+ cheZ)+B0015 复苏(J04500+K117000+B0015) 2012/09/02 菌液PCR验证(R0084+B0034+ cheZ)+B0015 保种(R0084+B0034+ cheZ+B0015) HSP promoter验证实验version 1.0(第二天) 复苏pSB1C3+(J01003+I13521)、K117010、(HSP promoter+E0240)、pSB1C3 转化R0040

Period 5 Biosafety


Sep 03-Sep 22 验证实验升级中~~ 尝试构建终极通路: 准备标准组件 2012/09/03 Death gene验证实验version 2.0(第一天) 质粒小提pSB1C3+(J01003+I13521)、pSB1C3 菌液PCR用于酶切K117010、(HSP promoter+E0240) 双酶切pSB1C3+(J01003+I13521)(S&P)、K117010(X&P)、pSB1C3(E&P)、(HSP promoter+E0240)(E&P) 挑单菌落R0040 2012/09/04 0903酶切回收 酶接pSB1C3+(J01003+I13521)+K117010、pSB1C3+(HSP promoter+E0240) Death gene验证实验version 2.0(第二天) 复苏B0015 菌液PCR验证R0040 保种R0040 2012/09/05 酶接纯化 转化pSB1C3+(J01003+I13521)+K117010、pSB1C3+(HSP promoter+E0240) 菌液PCR用于酶切groE 质粒小提B0015 双酶切groE(E&S)、B0015(E&X) 2012/09/06 挑单菌落pSB1C3+(J01003+I13521)+K117010、pSB1C3+(HSP promoter+E0240) 酶切回收groE(E&S)、B0015(E&X) 酶接groE+B0015 复苏B0034、R0040 2012/09/07 酶接纯化groE+B0015 转化groE+B0015 菌液PCR验证pSB1C3+(J01003+I13521)+K117010、pSB1C3+(HSP promoter+E0240) 保种pSB1C3+(J01003+I13521)+K117010、pSB1C3+(HSP promoter+E0240) 质粒小提B0034、pSB1C3+(J01003+I13521)+K117010、pSB1C3+(HSP promoter+E0240) 菌液PCR用于酶切R0040 双酶切R0040(E&S)、B0034(E&X) 复苏pSB1C3+(R0084+B0034) 2012/09/08 挑单菌落groE+B0015 酶切回收R0040(E&S)、B0034(E&X) 酶接R0040+B0034 质粒小提pSB1C3+(HSP promoter+E0240) 菌液PCR用于酶切pSB1C3+(R0084+B0034) 双酶切pSB1C3+(HSP promoter+E0240)(S&P)、pSB1C3+(R0084+B0034)(X&P) 2012/09/09 酶接纯化 转化R0040+B0034 酶切回收pSB1C3+(HSP promoter+E0240)(S&P)、pSB1C3+(R0084+B0034)(X&P) 酶接pSB1C3+(HSP promoter+E0240)+(R0084+B0034) 菌液PCR验证groE+B0015 保种(groE+B0015) 复苏J04500 2012/09/10 挑单菌落R0040+B0034 酶接纯化pSB1C3+(HSP promoter+E0240)+(R0084+B0034) 转化pSB1C3+(HSP promoter+E0240)+(R0084+B0034) 质粒小提(groE+B0015) 双酶切(groE+B0015)(E&X) 复苏B0015、pSB1C3 2012/09/11 菌液PCR验证R0040+B0034 保种(R0040+B0034) 酶切回收(groE+B0015)(E&X) 菌液PCR用于酶切(R0040+B0034)、groES 质粒小提B0015、pSB1C3 双酶切(R0040+B0034)(E&P)、groES(E&P)、pSB1C3(E&P)、groES(E&S)、B0015(E&X) 挑单菌落pSB1C3+(HSP promoter+E0240)+(R0084+B0034) 2012/09/12 菌液PCR验证pSB1C3+(HSP promoter+E0240)+(R0084+B0034) 保种pSB1C3+(HSP promoter+E0240)+(R0084+B0034) 质粒小提pSB1C3+(HSP promoter+E0240)+(R0084+B0034) 酶切回收(R0040+B0034)(E&S)、(R0040+B0034)(E&S)、groES(E&P)、pSB1C3(E&P)、groES(E&S)、B0015(E&X) 酶接pSB1C3+(R0040+B0034)、groES+pSB1C3、groES+B0015、(R0040+B0034)+(groE+B0015) 复苏pSB1C3 2012/09/13 酶接纯化pSB1C3+(R0040+B0034)、groES+pSB1C3、groES+B0015、(R0040+B0034)+(groE+B0015) 转化pSB1C3+(R0040+B0034)、groES+pSB1C3、groES+B0015、(R0040+B0034)+(groE+B0015) 质粒小提pSB1C3 质粒PCR用于酶切groES+B0015 双酶切pSB1C3(E&P)、groES+B0015(E&P) 2012/09/14 挑单菌落pSB1C3+(R0040+B0034)、groES+pSB1C3、groES+B0015、(R0040+B0034)+(groE+B0015) 酶切回收pSB1C3(E&P)、groES+B0015(E&P) 酶接pSB1C3+(groES+B0015) 2012/09/15 酶接纯化pSB1C3+(groES+B0015) 转化pSB1C3+(groES+B0015) 菌液PCR验证pSB1C3+(R0040+B0034)、groES+pSB1C3、groES+B0015、(R0040+B0034)+(groE+B0015) 保种(pSB1C3+R0040+B0034)、(groES+pSB1C3)、(groES+B0015)、(R0040+B0034+groE+B0015) 质粒小提(pSB1C3+R0040+B0034)、(groES+pSB1C3) 2012/09/16 挑单菌落pSB1C3+(groES+B0015) 菌液PCR验证pSB1C3+(groES+B0015) 保种pSB1C3+(groES+B0015) 质粒小提pSB1C3+(groES+B0015) 寄出所构建的标准组件
2012/09/17 休息 2012/09/18 休息 2012/09/19 复苏验证实验所需菌种
2012/09/20 Death gene 验证实验 version 3.0 (第一天) HSP promoter验证实验 version 2.0 (第一天) Conjugation 验证实验 version 3.0 (第一天) Sweet gene 验证实验 version 1.0 (第一天) 2012/09/21 Death gene 验证实验 version 3.0 (第二天) HSP promoter验证实验 version 2.0 (第二天) Conjugation 验证实验 version 3.0 (第二天) Sweet gene 验证实验 version 1.0 (第二天) 2012/09/22 Death gene 验证实验 version 3.0 (第三天) Conjugation 验证实验 version 3.0 (第三天)



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